酒當歸水煎液各極性部位制備方法、成分分析與補血活性研究

何 建，紀 鵬，李琛琛，華永麗，姚萬玲，魏彥明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

當歸別名岷歸，為傘形科(Umbelliferae)多年生草本植物當歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根，是甘肅省道地藥材，味甘、辛、微苦，性溫，既可扶正補養(yǎng)又可攻邪治病[1-2]，主要功效為補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便，具有極高的藥用和保健價值[3]，被廣泛用于獸醫(yī)臨床上。其所含成分豐富，包括多糖、阿魏酸、香豆素、揮發(fā)油、黃酮、微量元素等[4]。資料記載，當歸多炮制后使用，臨床常用的炮制品有酒當歸、土當歸、當歸炭等[5]。酒當歸補血效果最佳，在獸醫(yī)臨床上使用較多，且往往以水煎液的形式使用。為促進獸醫(yī)臨床上酒當歸補血產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用，篩選酒當歸水煎液中最佳補血活性部位具有重要意義。

超聲輔助液液萃取法是基于液-液萃取法并輔以超聲技術(shù)的一種新方法，它主要是用超聲波在超聲過程中產(chǎn)生的一系列效應(yīng)，來對萃取過程中的傳質(zhì)作用進行加速[6]，最終提高萃取效率。索氏提取是一種液固萃取方法，其用在沸騰時冷凝下來的萃取溶劑對被萃取樣品進行反復(fù)萃取[7]。兩者相比，各具優(yōu)點[7]。為篩選酒當歸水煎液中較優(yōu)補血活性部位，本試驗基于酒當歸水煎液中化學(xué)成分極性大小，依據(jù)超聲輔助萃取與索氏提取兩種方法，從酒當歸水煎液中分別制備乙酸乙酯部位、正丁醇部位與水部位。通過綜合比較各部位的得率，篩選出最佳制備方案，采用高效液相色譜法對各部位成分進行初步分析，另采用動物試驗，比較各部位的補血效果，為獸醫(yī)臨床補血藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與主要試劑 當歸購自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)教研室鑒定為當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels。經(jīng)切制、清洗與曬干后，按《甘肅省中藥炮制規(guī)范》制備成酒當歸，存放于實驗室備用。甲醇、乙腈、冰乙酸(均為色譜純)，Sigma公司產(chǎn)品；乙酸乙酯(分析純)、正丁醇(分析純)，煙臺市雙雙化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 清潔級昆明小鼠80只，雌雄各半，體重23 g±2 g，由蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供(許可證編號 SCXK (甘) 2015-0001)。

1.1.3 主要儀器 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；YP 1102H型分析天平，上海精密科學(xué)有限公司產(chǎn)品；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；玻璃蛇形脂肪提取器，鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司產(chǎn)品；BC5300Vet五分類動物血液細胞分析儀，邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 酒當歸水煎液樣品的制備 根據(jù)前期單因素結(jié)合響應(yīng)面分析法得到的酒當歸水煎液最佳提取條件進行酒當歸水煎液的制備[8]。共提取3次，3次得到的水煎液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，濃縮至浸膏后置于真空干燥箱中干燥，得到干粉。

1.2.2 酒當歸水煎液各極性部位提取

1.2.2.1 超聲輔助萃取法

(1)乙酸乙酯部位：精密稱取酒當歸水煎液干粉(過40目篩)10 g，溶于100 mL蒸餾水中，加入100 mL乙酸乙酯，超聲輔助萃取1 h。重復(fù)萃取3次，每次萃取完后置于分液漏斗中靜置1 h，收集上層溶液。合并萃取液，濃縮到一定體積后真空干燥至恒重，所得物質(zhì)即為酒當歸水煎液的乙酸乙酯部位。

(2)正丁醇部位：上述乙酸乙酯部位提取后，下層液體置于通風(fēng)櫥中，在微控數(shù)顯電熱板上使其揮發(fā)至無乙酸乙酯。加入正丁醇100 mL，同樣采用上述超聲輔助萃取3次，合并萃取液體，并濃縮到一定體積后真空干燥至恒重，所得淡黃色干粉物質(zhì)即為酒當歸水煎液的正丁醇部位。

(3)水部位：上述正丁醇部位提取后，采用以上操作最終制備出的棕褐色干粉物質(zhì)即為酒當歸水煎液的水部位。

1.2.2.2 索氏提取法

(1)乙酸乙酯部位：精密稱取酒當歸水煎液干粉(過40目篩)10 g，將其置于脫脂濾紙包內(nèi)，放入玻璃蛇形脂肪提取器中。在圓底燒瓶內(nèi)加入300 mL乙酸乙酯，并置于溫度為85℃的恒溫水浴鍋進行回流提取。當玻璃蛇形脂肪提取器內(nèi)的乙酸乙酯溶液變成無色，則終止提取。

(2)正丁醇部位：將乙酸乙酯部位提取完全的濾紙包置于通風(fēng)櫥中使乙酸乙酯殘留物揮發(fā)完全。再采用上述方法，加蒸餾水300 mL，在電熱套中回流提取制備成正丁醇部位。

(3)水部位：將正丁醇部位提取完全的濾紙包置于通風(fēng)櫥中，使正丁醇殘留物揮發(fā)完全。再采用上述方法，加蒸餾水300 mL，在電熱套中回流提取制備成水部位。

得率=(不同提取部位平均質(zhì)量÷酒當歸水煎液干粉質(zhì)量)×100%

1.2.3 各部位成分分析

1.2.3.1 多糖含量測定

(1)葡萄糖標準曲線的制作(苯酚-硫酸法)：精確稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品100 mg于100 mL容量瓶，加蒸餾水搖勻、定容，作為母液。分別吸取1、2、3、4、5、6 mL母液于 mL的容量瓶，加蒸餾水定容，得到濃度分別為20、40、60、80、100、120 μg/mL的葡糖糖標品溶液。精確吸取1 mL不同濃度的標品溶液于干燥的具塞試管中，各試管分別滴加1.8 mL g/L的苯酚溶液，再緩慢加入7.5 mL濃硫酸，充分混勻，密封后沸水浴加熱20 min，待冷卻后測定吸光度。以相同處理的蒸餾水為空白，于483 nm波長測得各濃度的OD值，平行測定3次，求其平均值，繪制葡萄糖濃度的標準曲線。

(2)各部位中粗多糖的制備與總糖含量測定：分別精確稱取1 g酒當歸水煎液的3個部位的干粉于3個三角瓶中，加入2 mL蒸餾水溶解，然后加入無水乙醇使其最終含乙醇濃度為65.80%，密封靜置12 h。然后抽濾獲得上層漂浮物。將獲得的漂浮物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚充分潤洗后真空干燥成粉末，即得各部位中的當歸粗多糖。精確稱取10 mg的上述粗多糖于 mL的容量瓶中，加入蒸餾水，超聲處理(40 kHz，50℃，30 min)使其完全溶解后定容。按照上述的苯酚-硫酸法測定樣品的OD值，得到3次平行的平均值。

(3)果糖標準曲線的制備：分別精密吸取100、150、200、250、300、350、400 μL的果糖標準品溶液(1 mg/mL)于試管中，分別加入400 μL的DNS顯色劑，定容至5 mL并加試管塞，于沸水浴中加熱5 min，用流水迅速冷卻至室溫振蕩搖勻，室溫放置0.5 h后于510 nm處測定OD值。

(4)樣品的處理及還原糖的測定：精確稱取醇沉后的干粉10 mg，定容于10 mL的容量瓶中，吸取400 μL的待測液按上述DNS法測定樣品的吸光度值A(chǔ)，得到3次平行的平均值。

多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

1.2.3.2 HPLC分析

(1)各極性部位樣品的前處理：分別取各部位樣品0.05 mg，采用70%色譜甲醇定容到10 mL容量瓶中，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液于4℃貯藏備用。

(2)色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；紫外檢測器。乙酸乙酯部位：流動相：1 mL/L冰乙酸A-甲醇B；梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；柱溫：28℃；檢測波長：280 nm[9]；進樣量10 μL；正丁醇部位：流動相：8.5 mL/L磷酸A-乙腈B；梯度洗脫，流速1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：316 nm[10]；進樣量10 μL；水部位：流動相：0.85%磷酸A-乙腈B；梯度洗脫，流速0.8 L/min；柱溫：35℃；檢測波長：316 nm[10]；進樣量10 μL。

1.2.4 動物分組與造模 試驗動物為清潔級昆明小鼠80只，雌雄各半，體重23 g±2 g，購于蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心。待適應(yīng)環(huán)境3 d后，將它們隨機分為8個組，這些組分別命名為正常對照組(NC)、模型組(M)、乙酸乙酯部位低、高劑量干預(yù)組(EAL與EAH)，正丁醇部位低、高劑量干預(yù)組(NBL與NBH)，水部位低、高劑量干預(yù)組(WL與WH)。各部位干預(yù)組分別灌胃等量不同部位溶液(10 g/kg)，正常對照組給予等量蒸餾水，模型組給予同樣體積蒸餾水。于每天早上9點灌胃，每隔24 h灌胃1次，持續(xù)9 d。模型組、各部位干預(yù)組分別于給藥第2日及第5日，給予乙酰苯肼生理鹽水溶液(劑量分別為20 mg/kg與40 mg/kg，皮下注射)，從第5日起，每日給予環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液(40 mg/kg，腹腔注射)，持續(xù)4 d。正常對照組同時注射等量生理鹽水。

1.2.5 動物一般行為學(xué)觀察 觀察各組小鼠被毛色澤、精神等情況。

1.2.6 取材及檢測 各組于試驗結(jié)束后，麻醉后取血做血常規(guī)檢測，檢測各組小鼠全血中的紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血紅蛋白(Hb)指標。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)整理后，計量資料用mean±SD表示，使用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間差異比較采用采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲輔助萃取和索氏提取兩種方法制備酒當歸水煎液各極性部位得率

超聲輔助萃取、索氏提取兩種方法制備酒當歸水煎液各極性部位得率見表1和表2。超聲輔助萃取制得乙酸乙酯部位得率為0.686%，正丁醇部位得率為6.218%，水部位得率為83.99%。索氏提取制得乙酸乙酯部位得率為0.252%，正丁醇部位得率為3.209%，水部位得率為84.028%。

2.2 酒當歸水煎液不同極性部位多糖含量分析

葡萄糖的標準曲線見圖1，可得葡萄糖標準曲線的回歸方程，表明吸光度值與葡萄糖濃度在20 μg/mL～140 μg/mL范圍內(nèi)成線性相關(guān)。

y=0.008x+0.127 (R2=0.998 7)

表1 超聲輔助萃取酒當歸水煎液各極性部位得率

表2 索氏提取酒當歸水煎液各極性部位得率

圖1 葡萄糖標準曲線

果糖標準曲線見圖2，可得果糖標準曲線的回歸方程，表明吸光度值與果糖濃度在20 μg/mL～100 μg/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)。

y=0.009x-0.173 (R2=0.999)

圖2 果糖標準曲線

酒當歸水煎液中乙酸乙酯部位與正丁醇部位未檢出多糖，水部位中1 mg粗多糖中總糖為628.94 μg，還原糖為376.375 μg，所以水部位中1 mg粗多糖中的多糖含量為252.565 μg。

2.3 酒當歸水煎液不同極性部位HPLC初步分析

采用高效液相色譜法(HPLC)對各部位進行成分初步分析，乙酸乙酯、正丁醇與水部位的HPLC分析圖譜分別見圖3、圖4和圖5，酒當歸乙酸乙酯部位、正丁醇部位與水部位中峰的個數(shù)與強度具有明顯差異。

圖3 酒當歸乙酸乙酯部位的高效液相色譜圖

2.4 酒當歸水煎液不同極性部位補血活性分析

2.4.1 臨床觀察 和NC組比較，M組小鼠毛雜亂無章，沒有光澤，眼睛反應(yīng)不靈敏，動作遲鈍緩慢，無精神，耳朵、尾部沒有血色，喜歡呆在一起。和M組小鼠比較，各部位干預(yù)組的小鼠，有精神，尾巴、耳朵顏色正常，小鼠被毛有一定的光澤、動作反應(yīng)敏捷。其中WH組小鼠表現(xiàn)最接近NC組，其次為NBH組。

2.4.2 酒當歸水煎液對血虛小鼠血常規(guī)的影響 小鼠血常規(guī)檢測結(jié)果見圖6。與正常對照組相比較，模型組小鼠血液中的RBC、WBC數(shù)目與Hb含量均顯著減少(P<0.05)。與模型組相比，各部位干預(yù)組小鼠血液中的RBC、WBC數(shù)目與Hb含量均顯著升高(P<0.05)。與乙酸乙酯部位高劑量干預(yù)組相比，除WBC指標外，水部位高劑量干預(yù)組與正丁醇部位高劑量干預(yù)組小鼠血液中的RBC數(shù)目與Hb含量均顯著升高(P<0.05)。與水部位低劑量干預(yù)組相比較，水部位高劑量干預(yù)組小鼠血液中的RBC、WBC數(shù)目與Hb含量顯著升高(P<0.05)。與正丁醇部位低劑量干預(yù)組相比較，除WBC指標外，正丁醇部位高劑量干預(yù)組各指標均顯著升高(P<0.05)。說明水部位與正丁醇部位對血虛小鼠的干預(yù)效果較好，且具有一定的量效關(guān)系。

圖4 酒當歸水煎液正丁醇部位的高效液相色譜圖

圖5 酒當歸水煎液水部位的高效液相色譜圖

3 討論

中獸醫(yī)學(xué)對保障我國畜牧業(yè)健康發(fā)展發(fā)揮了重要作用，長期以來用于預(yù)防和治療畜禽疾病，具有效果確實、毒副作用小和不易形成耐藥性、確保動物性食品安全等優(yōu)點，符合現(xiàn)代畜牧業(yè)綠色發(fā)展的需求。從動物價值與福利來考慮，畜禽發(fā)生血虛對其生產(chǎn)性能影響很大[11]。血虛主要是由氣血生化不足和失血過多兩方面引起，中獸醫(yī)學(xué)理論認為“虛則補之”，因此治療動物血虛重在養(yǎng)血補血。當歸為甘肅道地藥材，對畜禽有顯著補血效果[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，當歸中主要補血成分為當歸多糖[13]。當歸炮制方法常包括油炒、酒炒、土炒與炒炭[14]。當歸經(jīng)炮制后，所含的主要活性成分會發(fā)生顯著變化[15-16]，其藥效也隨之發(fā)生顯著變化[17]，且有資料顯示當歸酒炙后補血效果顯著增強[18]。中藥水煎液形式為目前臨床常見劑型，吸收快且療效佳，但是其也存在一定的弊端，如給藥比較困難、藥物容易浪費等。因此，基于化學(xué)與動物試驗相結(jié)合的方法，嘗試分離篩選出酒當歸水煎液中有效補血成分具有一定的臨床價值。

字母不同表示差異顯著(P<0.05) The different letters denote significant difference (P<0.05)

本研究通過比較對酒當歸水煎液進行分離提取各極性部位的兩種方法，結(jié)果顯示超聲輔助萃取所得乙酸乙酯、正丁醇部位約為索氏提取量的3倍，證實應(yīng)用超聲輔助技術(shù)來強化提取過程，可有效提高提取效率，節(jié)約成本，經(jīng)分析原因可能是酒當歸水煎液浸膏所得干粉含糖量較高、易結(jié)塊，導(dǎo)致索氏提取法未能充分提取，而超聲輔助萃取技術(shù)更加適于分離提取酒當歸水煎液各部位，這與以往報道相符[19]。

為篩選酒當歸最佳補血部位，以乙酰苯肼與環(huán)磷酸酰胺聯(lián)合復(fù)制小鼠血虛動物模型，血液紅細胞、白細胞數(shù)和血紅蛋白含量顯著下降，表明小鼠血虛模型建立成功，而不同極性部位的酒當歸水煎液對乙酰苯肼與環(huán)磷酰胺引起的血虛模型，具有明顯升高紅細胞、白細胞數(shù)和血紅蛋白含量的作用以發(fā)揮對血虛模型小鼠的治療作用，其中以水部位(劑量1.24 g/mL)與正丁醇部位(劑量0.1 g/mL)對血虛的治療效果較好。

多糖成分檢測與HPLC-UV分析比較各部位成分，發(fā)現(xiàn)酒當歸水煎液中乙酸乙酯部位與正丁醇部位未檢出多糖，水部位中1 mg粗多糖中總糖為628.94 μg，還原糖為376.375 μg，表明水部位中1 mg粗多糖中的多糖含量為252.565 μg。HPLC-UV分析，顯示酒當歸乙酸乙酯部位、正丁醇部位與水部位中峰個數(shù)與強度具有明顯差異。其中乙酸乙酯部位的檢測波長為280 nm，正丁醇和水部位的均為316 nm，查閱文獻[9-10]，并結(jié)合摸索液相分析條件發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位在280 nm處，可以檢測出較多種類物質(zhì)，而正丁醇和水部位均在316 nm可以檢測出較多種類物質(zhì)。不同部位峰個數(shù)與強度差異較大，經(jīng)分析原因可能是3個部位因極性的不同，造成各部位成分出現(xiàn)多樣性差異。正丁醇部位與水部位補血效果較好，可以推測這2個部位所含的補血成分含量較高，可為后續(xù)補血部位成分的深入研究奠定基礎(chǔ)，并為開發(fā)獸醫(yī)臨床當歸補血藥物提供依據(jù)。