枸杞多糖提取工藝優(yōu)化及不同產(chǎn)地枸杞質(zhì)量比較

彭 浩， 秦宏偉， 程有君， 劉正華， 李彥連， 宋文路

(1.濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜 273155； 2.山東博康中藥飲片有限公司，山東青州 262500)

枸杞果實(shí)枸杞子為我國傳統(tǒng)的寶貴中藥材，具有補(bǔ)腎養(yǎng)肝、潤肺明目、益精、補(bǔ)血等功效[1]?！吨腥A人民共和國藥典》2015版[2](以下簡(jiǎn)稱《藥典》)中枸杞子項(xiàng)下規(guī)定水分不得超過13%，總灰分不得超過5%，浸出物不得少于55%，以此作為評(píng)價(jià)枸杞子藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、增強(qiáng)免疫、保護(hù)視網(wǎng)膜、保護(hù)生殖系統(tǒng)、治療骨質(zhì)疏松等作用[3-6]，為《藥典》規(guī)定檢測(cè)的主要藥用活性成分，它的含量差異亦體現(xiàn)了枸杞品質(zhì)的差異。近年來枸杞種植面積不斷擴(kuò)大，產(chǎn)區(qū)已由道地主產(chǎn)區(qū)寧夏擴(kuò)大到河北、內(nèi)蒙古、甘肅、陜西、山西、新疆等省(自治區(qū))[7]。枸杞原料的產(chǎn)地來源與產(chǎn)品的品質(zhì)密切相關(guān)，不同產(chǎn)地的枸杞品質(zhì)存在不同程度的差異，低溫、高海拔、長日照有益于枸杞中主要活性成分的積累[8]。枸杞多糖提取的常用方法是熱水浸提法，但熱水浸提法提取時(shí)間長、耗能多。超聲波輔助提取法因超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)、攪拌作用等可以加速植物有效成分進(jìn)入溶劑，提高提取率，縮短提取時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟，在天然產(chǎn)物提取中顯示出了巨大優(yōu)勢(shì)[9-11]。本試驗(yàn)選用超聲波輔助法提取枸杞多糖，并通過正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，以期為該成分的開發(fā)利用提供依據(jù)。同時(shí)，以寧夏和河北栽培的枸杞為材料，對(duì)它們的水分、總灰分、浸出物及多糖提取率進(jìn)行測(cè)定分析與比較，以此作為中藥選材的依據(jù)。

1 材料

試驗(yàn)儀器為101A-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)、SX-4-10型箱式電阻爐(北京永光明醫(yī)療儀器總廠)、萬用電爐(一聯(lián)北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)、DRHH-54型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、BF-Ⅲ型薄層電動(dòng)涂鋪器(天津市思利達(dá)科技有限公司)、ZF-6型(三用紫外儀上海市金鵬分析儀器有限公司)、L6S型紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)、KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。試驗(yàn)用枸杞子分別產(chǎn)自寧夏和河北，并經(jīng)過濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系李彥連副教授鑒定為茄科枸杞屬植物枸杞(Lyciumbarbarum)的果實(shí)——枸杞子，低溫干燥避光保存；D-無水葡萄糖(含量為99.5%)和枸杞子對(duì)照藥材(均購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為1108—2025、121072—201410)，其他試劑均為分析純(AR)。本試驗(yàn)于2017年6月在山東博康中藥飲片有限公司及濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系進(jìn)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 LBP提取工藝流程

稱取干燥河北枸杞子粗粉0.5 g加入80%乙醇100 mL，加熱回流1 h，過濾，80%乙醇分次洗滌濾渣。濾渣中加入蒸餾水，超聲波處理，回流。過濾并冷卻后，蒸餾水定容至250 mL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

多糖測(cè)定采用改進(jìn)的苯酚-硫酸法[12]。使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品精確配制濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水定容至 2.0 mL。各加入1 mL 5%的苯酚、5 mL濃H2SO4，40 ℃水浴中保溫15 min，冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 LBP提取率的測(cè)定

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定容后的枸杞多糖溶液吸光度，根據(jù)式(1)計(jì)算枸杞多糖提取率。

枸杞多糖提取率=CVD/m×100%。

(1)

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的多糖濃度，g/mL；V為樣品溶液的定容體積，mL；D為枸杞多糖的稀釋倍數(shù)；m為枸杞原料質(zhì)量，g。

2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響枸杞多糖提取率的因素比較多，如料液比、提取溫度和時(shí)間、提取次數(shù)、pH值等。以超聲波作為多糖樣品的輔助提取方法，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

2.4.1 料液比對(duì)LBP提取率的影響 固定超聲時(shí)間為 30 min，加熱回流提取時(shí)間為60 min，測(cè)定料液比分別為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60(g ∶mL)時(shí)的多糖提取率，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，多糖的提取率隨著料液比的增加而逐漸增大。這是由于溶劑的增加有利于多糖的擴(kuò)散傳質(zhì)，從而增加多糖的提取率[13]。當(dāng)料液比達(dá)1 g ∶40 mL后，隨著水量的增加，提取率增加不明顯，而且當(dāng)料液比超過1 g ∶50 mL后，過多的溶劑則會(huì)消耗大量超聲波輻射能量，影響多糖的析出，因而提取率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。所以提取料液比選取在 1 g ∶40 mL 左右。

2.4.2 回流時(shí)間對(duì)LBP提取率的影響 固定料液比 1 g ∶40 mL，超聲時(shí)間為30 min，測(cè)定加熱回流提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180 min時(shí)的多糖提取率，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著回流時(shí)間的增加，多糖的提取率也在增加，且在120 min內(nèi)增加顯著，之后趨于平緩。本著節(jié)能原則，回流提取時(shí)間在120 min左右為宜。

2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)LBP提取率的影響 固定料液比 1 g ∶40 mL，加熱回流提取時(shí)間為120 min，測(cè)定超聲時(shí)間分別為30、45、60、75、90、105 min時(shí)的多糖提取率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在超聲時(shí)間為30～60 min之間時(shí)，多糖提取率隨超聲時(shí)間的增加而上升，但是當(dāng)超聲時(shí)間超過60min后提取率緩慢下降。超聲波時(shí)間短使多糖不能充分溶解，但超聲波處理時(shí)間過長其強(qiáng)剪切作用使大分子多糖斷裂，造成多糖的損失[14]。所以超聲時(shí)間應(yīng)選取在60 min左右。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取料液比、超聲時(shí)間、回流時(shí)間3個(gè)因素的各3個(gè)適宜水平(表1)，按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)[12]，優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取工藝條件，結(jié)果如表2所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 LBP提取率方差分析

為進(jìn)一步確定超聲波輔助法提取LBP的最佳工藝條件，評(píng)估和判斷試驗(yàn)誤差和條件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。由表2和表3可知，料液比、回流時(shí)間、超聲時(shí)間都會(huì)影響LBP提取率，且均達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。由于RC>RA>RB，所以超聲時(shí)間對(duì)提取率影響最大。由k值可知最優(yōu)水平為A3B2C3，即料液比1 g ∶50 mL、回流時(shí)間120 min、超聲時(shí)間70 min。

表3 方差分析

注：“**”表示差異顯著(P<0.05)。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)通過正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)的提取率平均值為(9.06±0.23)%，接近預(yù)期值，且顯著高于其他條件下的LBP提取率。

2.8 不同產(chǎn)地枸杞的質(zhì)量評(píng)價(jià)

選用水分、總灰分、浸出物和多糖提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)河北枸杞子和寧夏枸杞子進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。將干燥枸杞子粉碎，過二號(hào)篩[24目，篩孔內(nèi)徑為(850±29) μm]備用。

2.8.1 水分測(cè)定法 參照《藥典》中的烘干法進(jìn)行測(cè)定，精確稱取2種枸杞子粉末各3份，每份2 g，計(jì)算供試樣品含水量(%)，結(jié)果如表4所示。由表4可知，2種枸杞子的水分均符合《藥典》中不得超過13.0%的要求。

2.8.2 總灰分測(cè)定 參照《藥典》中的總灰分測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，精確稱取2種枸杞子粉末各3份，每份2 g，計(jì)算供試品中總灰分的含量(%)，結(jié)果如表4所示。由表4可知，2種枸杞子的總灰分測(cè)定均低于《藥典》5.0%的要求。

表4 不同產(chǎn)地枸杞中水分、總灰分、浸出物及多糖提取率

2.8.3 浸出物測(cè)定 參照《藥典》中的熱浸法進(jìn)行浸出物測(cè)定，精確稱取2種枸杞子粉末各3份，每份4 g，計(jì)算浸出物的含量(%)，結(jié)果如表4所示。由表4可知，2種枸杞子的浸出物含量均符合《藥典》中不得少于55.0%的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

2.8.4 糖類的定性鑒別 干燥的枸杞子粉末0.5 g，加水溶解至50 mL后將其置于加熱套中加熱回流15 min，冷卻過濾后濾液置于梨形分液漏斗中加入15 mL乙酸乙酯萃取，將萃取的乙酸乙酯液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中沸水浴濃縮至1 mL，得到供試品溶液。采用同樣的方法制備枸杞對(duì)照藥材溶液，作為對(duì)照。按照薄層色譜法試驗(yàn)，各吸取5 μL供試品溶液和對(duì)照溶液分別點(diǎn)至同一硅膠G薄層板，將其放置在展缸中，加入展開劑(比例為3 ∶2 ∶1的乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸)，展開，至8 cm后小心取出晾干，將硅膠薄板置于紫外光燈(365 nm)下檢視。由圖4可知，2種枸杞子中均含有多糖成分。

2.8.5 枸杞多糖提取率測(cè)定 按照“2.6”節(jié)優(yōu)化出的最佳工藝條件分別提取2種枸杞多糖，并進(jìn)行提取率測(cè)定。由表4可知，寧夏枸杞多糖提取率明顯高于河北枸杞。

2.8.6 2種枸杞多糖的體外抗氧化性分析與比較

2.8.6.1 2種枸杞多糖的總抗氧化能力比較 采用FRAP法[15-16]，分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的2種枸杞多糖水溶液進(jìn)行測(cè)定，空白組以水代替樣品，對(duì)照組則為同等質(zhì)量濃度的維生素C溶液。以1.0 mmol/L FeSO4溶液為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需FeSO4的濃度(μmol/L)表示，定義為FRAP值，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，寧夏枸杞和河北枸杞多糖總抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，其總抗氧化能力分別達(dá)到99.39、86.25 μmol/L，說明2種枸杞多糖均具有一定的總抗氧化能力。但與同質(zhì)量濃度的維生素C相比，枸杞多糖的FRAP值較小，說明總抗氧化能力略小。此外，在相同質(zhì)量濃度下，寧夏枸杞總抗氧化能力顯著高于河北枸杞。

2.8.6.2 2種枸杞多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力比較 參考Atoui等的測(cè)定方法[16-17]，分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的2種枸杞多糖的水溶液進(jìn)行試驗(yàn)，空白組以水代替樣品，對(duì)照組則為同等質(zhì)量濃度的維生素C。DPPH自由基清除率按式(2)計(jì)算，結(jié)果如圖6所示。

(2)

式中：D1為樣品組的吸光度，D0為空白組的吸光度。

由圖6可知，質(zhì)量濃度在0～25 mg/mL范圍內(nèi)，2種枸杞多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨樣品質(zhì)量濃度升高而增大。當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，寧夏枸杞和河北枸杞多糖對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到最大值，分別為60.98%和56.39%，說明2種枸杞均具有一定的DPPH自由基清除能力。與同質(zhì)量濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品相比，2種枸杞多糖對(duì)DPPH自由基的清除率略小，但在相同質(zhì)量濃度下，寧夏枸杞多糖對(duì)DPPH自由基清除能力明顯高于河北枸杞多糖。

2.8.6.3 2種枸杞多糖對(duì)羥自由基的清除能力比較 采用 2- 脫氧核糖法[16，18]，分別取500 μL不同質(zhì)量濃度的2種枸杞多糖的水溶液進(jìn)行試驗(yàn)，空白組以水代替樣品，對(duì)照組則為同等質(zhì)量濃度的維生素C。DPPH自由基清除率按式(3)計(jì)算，結(jié)果如圖7所示。

(3)

式中：D1為樣品組的吸光度，D0為空白組的吸光度。

由圖7可知，質(zhì)量濃度在0～25 mg/mL范圍內(nèi)，2種枸杞多糖對(duì)羥自由基的清除率隨樣品質(zhì)量濃度升高而增大。在25 mg/mL時(shí)，寧夏枸杞和河北枸杞多糖對(duì)羥自由基清除率達(dá)到最大值，分別為82.02%和81.96%。2種枸杞多糖羥自由基清除能力差異不明顯，但均略大于同質(zhì)量濃度下維生素C的羥自由基清除率，說明2種枸杞多糖具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和SPSS 19.0軟件對(duì)LBP提取條件進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到優(yōu)化后的工藝條件為料液比 1 g ∶50 mL，回流時(shí)間120 min、超聲時(shí)間70 min。各因素對(duì)LBP提取率的影響順序?yàn)槌晻r(shí)間>料液比>回流時(shí)間，驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，表明通過正交試驗(yàn)所得的優(yōu)化條件穩(wěn)定、可靠。同時(shí)，比較了不同產(chǎn)地枸杞水分、總灰分、浸出物和多糖提取率。從測(cè)定結(jié)果可以看出，寧夏枸杞和河北枸杞均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，但二者多糖提取率差別較大，其中，采用優(yōu)化工藝提取并測(cè)定的寧夏枸杞多糖提取率更高，達(dá)21.39%，且寧夏枸杞多糖的抗氧化活性優(yōu)于河北多糖。近年來枸杞配方的中藥產(chǎn)品逐年增加，大多數(shù)取其補(bǔ)益和增強(qiáng)免疫功能的作用，產(chǎn)品的功效與枸杞多糖抗氧化活性有密切的關(guān)系，本試驗(yàn)的結(jié)果能為枸杞多糖的開發(fā)利用、有關(guān)廠家選擇用藥及適當(dāng)調(diào)整枸杞用藥劑量提供可參考的依據(jù)。