復合益生菌對大菱鲆生長指標、血液生理生化指標的影響

暴寧　司濱　王連順　韓雨哲　姜志強　任同軍

摘 要：探討復合益生菌對大菱鲆生長指標和血液生理生化指標的影響，結果表明復合益生菌作為飼料添加劑可以有效提高大菱鲆的增重率、特定生長率、飼料利用率，一定程度上影響了大菱鲆全魚及背部肌肉的粗成分，但并沒有影響大菱鲆血液生理生化指標。

關鍵詞：益生菌；大菱鲆；生長指標；血液生理生化指標

大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）原產于歐洲，是一種冷水性底棲魚類，易接受配合飼料而且轉化率高，耐低氧且病害少，是北方海水養(yǎng)殖的優(yōu)良品種[1]。

由于益生菌具有增強免疫力、促進生長、維持動物消化道環(huán)境等功能，因此可作為新的綠色的添加劑廣泛運用于食品、醫(yī)藥、飼料等方面[2]。桂琳等研究發(fā)現添加復合益生菌的飼料能有效提高草魚的特定生長率、增重率、飼料利用率[3]。李小梅等也發(fā)現以光合細菌、短小芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌組成的復合益生菌作為飼料添加劑能有效促進斜帶石斑魚的生長性能，如特定生長率、體增重率、體增長率、肥滿度，且飼料系數也有所下降[4]。但是益生菌對大菱鲆生長的影響很少有報道。

動物機體的代謝過程中血液是動物體內循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分[5]。血液的生理生化指標是評價水產動物健康狀況、營養(yǎng)狀況及對環(huán)境的適應狀況的重要指標之一[6]。目前關于水產動物血液生理生化指標的研究報道很多[7-9]，但是關于復合益生菌作為飼料添加劑對大菱鲆血液的影響很少報道。

因此本試驗通過飼料中添加不同梯度的復合益生菌來探討其對大菱鲆生長性能和血液的影響，以期為大菱鲆高效、健康養(yǎng)殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 益生菌的來源與鑒定

本試驗所用復合益生菌由大連百安泰生物科技有限公司提供，該復合益生菌為菌液，根據Ran C. [10]的方法測定活菌總數為5×109 CFU/mL，在北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行16s rDNA V4區(qū)鑒定，以相對豐度值大小為標準，該復合益生菌主要含有醋桿菌屬（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas），其相對豐度分別為0.82、0.14、0.002。

1.2 試驗飼料的配制

根據Irfan Ambas等[11]的方法，試驗飼料制備分為兩個步驟，分別為基礎飼料的制備和菌液的噴灑。

基礎飼料的制備如下：飼料原料粉碎，過40目篩，利用攪拌機（B10高速三功能攪拌機）進行混勻，最后放入制粒機（東南干燥設備有限公司，XL-250）壓成粒徑分別為1.8 mm和2.0 mm的顆粒飼料，將制成的飼料放入烘箱中40 ℃烘干至水分為8%左右?；A飼料的配方主要有魚粉、魚油、大豆卵磷脂等，具體飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。

飼料制成后于-20 ℃保存，為保證試驗的準確，根據Ran C.[10]的方法定時測定活菌總數以確保每日活菌數符合試驗要求，具體結果見圖1。

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗是在大連海洋大學農業(yè)部北方重點試驗室進行，試驗所用大菱鲆幼魚購買于大連天正集團養(yǎng)殖場，試驗共進行60 d，具體操作及要求如下。試驗前將大菱鲆暫養(yǎng)兩周適應環(huán)境。試驗前禁食24 h，試驗分為三組，每組三個重復，共九個200 L方形藍色聚乙烯水槽，每個放養(yǎng)20尾魚，初始體重為（20.04±0.23） g。每日投喂兩次，分別為7：30和16：30，采取表觀飽食投喂。試驗中投喂顆粒飼料，根據圖2所示，20 d后活菌數有所下降已經不能達到試驗要求，因此需更換飼料。每日投喂前，利用虹吸法吸取殘餌糞便，每日的投喂量需進行稱重。馴養(yǎng)及正式試驗均采用靜水養(yǎng)殖，每日換水兩次以保證水質要求（9：30和18：00），日換水量為總體的40%～60%，24 h充氣。飼養(yǎng)期間保證光照一致，試驗期間定期測定養(yǎng)殖水體鹽度，每周測定養(yǎng)殖水體溶氧、溫度和pH值。試驗期間水溫為17.8±1.23 ℃、溶氧為6.96±0.71 mg/L、pH值為8.20±0.20，鹽度32.00±2.00‰。

圖1 Log10的飼料中復合益生菌總數

1.4 試驗樣品的采集

試驗結束后，對大菱鲆的生長指標進行測定，測定前大菱鲆需停食24 h，以確保魚腹中沒有殘余餌料從而引起誤差。將水槽中的所有大菱鲆取出，用干凈的紗布擦去表面的水分進行稱量，計算增重率、飼料系數、特定生長率、肥滿度。從每個試驗組的三個平行中隨機選取5尾魚于冰盤上取其內臟測定其肝體比、臟體比，并進行尾部取血，采集到的血液分為兩個部分：一部分加入肝素鈉抗凝劑，用于測定血常規(guī)。另一部分血液于4 ℃靜置，4 000 r/min離心10 min，取上清液，儲存于-80 ℃ 超低溫冰箱中，用于血清生化指標分析。此外在各水槽中隨機選取5尾魚用于測定肌肉和魚體的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分。

1.5 生長及攝食指標的測定

攝食期間魚的體增重率、特定增長率、飼料系數、肥滿度、臟體比、肝體比、腸體比、成活率分別按以下公式計算。

體增重率（%）=[（Wt-W0）/W0]×100

特定增長率（%/d）=[（lnWt-lnW0）/t]×100

飼料系數=C/Wt-W0）

肥滿度=（W/L3）×100

臟體比（%）=內臟重量/Wt×100

肝體比（%）=肝臟重量/Wt×100

腸體比（%）=腸道重量/Wt×100

成化率（%）=成活尾數/總尾數×100

其中W0為實驗中的初始體重，Wt為實驗魚的終末體重，t為實驗天數，C為攝食量，W為實驗魚體重量，L為魚體長度。

1.6 魚體及飼料成分分析

飼料、魚體及其肌肉的成分分析參考Liu 的方法[12]。其中水分含量按照國標GB/T 6435-1986 測定，粗蛋白含量按照國標 GB/T 6432-1994 測定，粗脂肪含量按照國標 GB/T 6433-1994 測定，粗灰分含量按照國標GB/T 6438-1992 測定。

1.7 血液生理指標測定

大菱鲆血液的主要生理指標包括：白細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度。這些指標的測定委托大連市體檢中心進行檢測，通過西斯美康XE-2100D（日本）直接測得。

1.8 血清生化指標測定

大菱鲆血清的主要生化指標包括：總蛋白、白蛋白、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸轉移酶。這些指標的測定均由大連市體檢中心進行檢測，通過西斯美康XE-2100D（日本）直接測得。

1.9 數據分析

數據以平均值±標準誤差（Mean±SE，n=3）表示，試驗結果用SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析 ，用Turkeys多重比較對全部處理進行方差分析，檢驗組間差異是否顯著，以P<0.05 為顯著性差異。

2 試驗結果與分析

2.1 復合益生菌對大菱鲆生長性能的影響

飼料中添加了復合益生菌對大菱鲆生長性能的影響見表2。由表可知飼養(yǎng)試驗結束后，飼料中添加了復合益生菌對大菱鲆的生長是有顯著性影響的。具體結果如下：與對照組（T0）相比，飼料中添加復合益生菌的處理組（T1和T2）的終末體重、特定生長率、增重率有顯著性增加（P<0.05），且添加5% 的復合益生菌的處理組（T2）的終末體重、特定生長率、增重率較添加1% 的復合益生菌的處理組（T1）顯著增加（P<0.05）。

2.2 復合益生菌對大菱鲆形體指標的影響

飼料中添加復合益生菌對大菱鲆形體指標的影響見表3，由表可知飼養(yǎng)試驗結束后，與T0相比，T1和T2的肥滿度有顯著增加（P<0.05），而臟體比、肝體比、腸體比并無顯著性差異（P>0.05）。T1與T2比較，肥滿度、臟體比、肝體比、腸體比并沒有顯著增加（P>0.05）。

2.3 復合益生菌對大菱鲆魚體及背部肌肉成分的影響

飼料中添加復合益生菌對大菱鲆魚體及背部肌肉成分的影響見表4。

由表對大菱鲆魚體成分分析可知與T0對比，T1和T2的粗蛋白是有顯著增加（P<005），水分、粗脂肪、粗灰分沒有顯著性差異 （P>0.05）。T1與T2對比，水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分是沒有顯著增加（P>0.05）。

針對于大菱鲆背部肌肉成分，由表可知T1和T2的粗蛋白與T0對比顯著增加（P<0.05）。其次與T0相比較，T1的粗灰分是沒有顯著增加 （P>005），而T2的粗灰分是有顯著下降（P<0.05）。此外T1和T2的水分、粗脂肪和T0相比沒有顯著性差異。T1與T2之間相對比，水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.4 飼料中添加復合益生菌對大菱鲆血液部分生理指標的影響

飼料中添加不同梯度的復合益生菌對大菱鲆血液生理指標的影響見表5，如表所示，與對照組相比，處理組T1和T2的大菱鲆血液中白細胞數目、紅細胞數目、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度均沒有顯著性的差異（P>0.05）。對處理組T1和T2的大菱鲆血液生理指標進行分析，也沒有顯著性的差異（P>0.05）。

2.5 飼料中添加復合益生菌對大菱鲆血液部分生化指標的影響

飼料中添加不同梯度的復合益生菌對大菱鲆血液生化指標的影響見表6，如表所示，與對照組相比，處理組T1和T2的大菱鲆血液中總蛋白，白蛋白，總膽固醇，高密度脂蛋白膽固醇，低密度脂蛋白膽固醇，丙氨酸氨基轉移酶，天門冬氨酸轉移酶的含量并沒有顯著性差異（P>0.05）。對處理組T1和T2的大菱鲆血液生化指標進行分析而得沒有顯著性的差異（P>0.05）。

3 討論

3.1 飼料中添加復合益生菌對大菱鲆生長的影響

從 kozasa[13]首次將微生態(tài)制劑應用于水產養(yǎng)殖業(yè)以來，益生菌制劑開始被作為添加劑添加于飼料當中，并隨著對益生菌研究的日益深入，其應用也日益廣泛。有研究表明，飼料中添加復合益生菌可促進水產動物的生長[14-16]，但復合益生菌對大菱鲆生長的影響很少報道，因此本研究就飼料中添加不同梯度的益生菌對大菱鲆生長的影響進行探討，試驗結果表明為期60 d的飼養(yǎng)試驗結束后，相對于對照組而言，含有復合益生菌的處理組的終末體重、增重率、特定生長率均有所提高，且飼料系數均有所下降。不同添加量的復合益生菌處理組之間在終末體重、增重率、特定生長率、飼料系數指標上也有顯著性的差異，表現為T2組的終末體重、增重率、特定生長率高于T1組。此結果說明將復合益生菌作為飼料添加劑能有效地促進大菱鲆的生長，提高飼料利用率，且添加量的不同表現為不同的生長性能與飼料利用率。

與本試驗結果相似的研究報道有很多。且研究發(fā)現復合益生菌的添加比單一益生菌更能促進水產動物的生長，如報道中指出復合益生菌作為飼料添加劑對大菱鲆的生長，飼料利用率均有明顯提高[17]，賴凱昭的研究也表明添加復合益生菌的處理組明顯比對照組羅非魚的終末體重、增重率、特定生長率高[18]，上述試驗結果的出現與益生菌促進水產動物生長的作用機理息息相關，目前研究發(fā)現益生菌對水產動物促生長的機理主要有以下兩個觀點：1、益生菌在水產動物腸道內定植，抑制和消除腸道內有害菌和病原菌，從而使腸道處于良好的穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境中，利于營養(yǎng)物質的吸收和消化，從而促進生長[19-20]。2、益生菌可以分泌維生素、氨基酸、促生長因子等，如分泌代謝酶類，補充內源性酶或將魚體不能吸收的大分子物質分解為易吸收的小分子物質，進而促進魚體生長，且其本身含有豐富的蛋白質、礦物質等，以補充機體所需的營養(yǎng)成分[21-22]。

本試驗的結果中還表明飼料中添加復合益生菌對大菱鲆的形體指標有一定的影響，具體表現為添加復合益生菌的處理組的肥滿度指數要高于對照組，對肝體比、腸體比、臟體比三個指數而言，對照組與處理組之間并沒有顯著性差異。此外添加復合益生菌的處理組T1與T2之間在肥滿度、肝體比、腸體比、臟體比方面并沒有顯著性差異。該試驗結果與王朝瑾[23]等研究的試驗結果有所不同，其研究結果表明添加不同梯度的復合益生菌對鯽魚的肥滿度、肝體比、腸體比、臟體比均有所提高。而產生上述試驗結果的不同的原因主要有兩個：首先益生菌的種類和添加量、試驗動物種類和規(guī)格的不同，且益生菌的活性及其對水產動物作用還受到養(yǎng)殖環(huán)境如鹽度、溫度等因素的影響[21]。其次根據高露姣等[24]和楊金海等[25]研究報道指出肝臟是動物儲存營養(yǎng)和中間代謝的主要器官，腸是主要消化器官，而益生菌對水產動物的不同消化器官的作用是不同的。綜上所述這些可能是導致水產動物形體指數和內臟指數產生各種變化的原因。

3.2 飼料中添加復合益生菌對大菱鲆體成分的影響

目前，關于益生菌對水產動物的體成分影響的研究報道不一致。張雯等[26]研究發(fā)現添加微生態(tài)制劑的處理組的肝臟粗脂肪含量明顯低于對照組，其他營養(yǎng)成分指標并沒有顯著性差異。而本試驗結果表明60 d 的飼養(yǎng)試驗結束后，經復合益生菌處理的試驗組中，大菱鲆全魚及肌肉的粗蛋白含量較對照組有顯著性的提高；與對照組相比，T1組的粗灰分含量沒有顯著性變化，T2組的粗灰分含量有所降低。上述試驗的不同結果可能由于益生菌的來源、種類、濃度，以及添加的比例，試驗動物的種類等多種因素造成的[21]。就本試驗的結果進行分析可能的原因在于益生菌在進入消化道后，能夠分解產生動物生長過程中所必需的營養(yǎng)物質，有報道指出益生菌能夠提高腸道消化酶活性，促進水產動物對營養(yǎng)物質的消化吸收，增強機體對蛋白質的沉積[26]，因此處理組中大菱鲆及其肌肉粗蛋白的含量顯著高于對照組。但是有關本試驗中處理組大菱鲆肌肉灰分含量減少的研究尚未報道，具體的機理還需進一步研究。

3.3 飼料中添加復合益生菌對大菱鲆血液生理生化指標的影響

血液中的生理生化指標反映了機體的健康狀況、營養(yǎng)狀況以及防御有害物質的能力[27]。蘇聯學者普契科夫及費多洛娃[28]研究表明食物的成分會對血液產生影響。因此本試驗通過飼料中添加復合益生菌對大菱鲆血液的影響進行研究，結果表明對T0、處理組T1和T2的大菱鲆血液生理生化指標進行對比并沒有顯著性的差異。目前有關益生菌對魚類血液生理生化指標的研究結果各不相同，黃永春[29]等研究發(fā)現飼料中添加EM菌可以使建鯉血液的紅細胞和血紅蛋白升高。與之不同的是袁豐華[30]等在研究地衣芽孢桿菌對尖吻鱸血液生理生化指標的影響時發(fā)現，攝食不同地衣芽孢桿菌含量的尖吻鱸血液中紅細胞、白細胞數量、血紅蛋白的含量與對照組并沒有顯著性差異，添加地衣芽孢桿菌的量為3.0 g/kg的飼料組其生化成分中膽固醇顯著低于對照組， 其他各試驗組均與對照組差異不顯著。上述實驗結果的不同可能是由于試驗動物的不同、益生菌的不同、養(yǎng)殖模式以及養(yǎng)殖環(huán)境中如溶氧、pH值的不同等諸多因素造成的[21]。但針對于本試驗來講，飼料中添加復合益生菌的濃度不足以改變大菱鲆血液生理生化指標，這可能是造成本試驗結果的原因之一，而最適宜的濃度尚未得知以及復合益生菌對大菱鲆血液影響的機理尚不明確，還需要進一步的研究。

4 小結

該復合益生菌作為飼料添加劑是可以有效提高大菱鲆的增重率、特定生長率、飼料利用率，但并沒有影響大菱鲆血液生理生化指標。該結果說明復合益生菌的添加對大菱鲆是有利的，沒有帶來不利影響。但是該復合益生菌的作用機理尚未得知，因此該研究還需進一步進行。

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