毛丙永,殷瑞敏,趙楠,崔樹茂,趙建新,張灝,陳衛(wèi)*
1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,四川 成都,610066)
四川泡菜風(fēng)味形成主要由蔬菜、輔料以及微生物代謝所提供[1]。四川泡菜發(fā)酵過程中,乳酸菌利用原料中的糖,在密閉的泡菜壇中通過發(fā)酵產(chǎn)生豐富的乳酸以及其他風(fēng)味物質(zhì),從而賦予四川泡菜獨(dú)特的風(fēng)味。發(fā)酵過程中乳酸積累,導(dǎo)致壇內(nèi)pH值降低,從而抑制一些腐敗菌的生長。泡菜中乳酸菌種類及含量直接影響到泡菜的質(zhì)量[2]。目前,國內(nèi)外學(xué)者從泡菜中分離到的乳酸菌主要有明串珠菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬和魏斯氏菌屬等[3-4]。
目前,四川泡菜的制作方式主要分兩大類:鹽溶液泡漬發(fā)酵和老鹵水泡制[3]。傳統(tǒng)四川泡菜是鹽水泡制新鮮蔬菜,經(jīng)厭氧發(fā)酵而成,壇內(nèi)鹽水是長期反復(fù)使用,在泡菜壇內(nèi)形成乳酸菌為主體的復(fù)合菌群,俗稱“老鹵水”[5],優(yōu)良的泡菜鹵水重復(fù)使用[6],其中的微生物處于活躍發(fā)酵狀態(tài)。老鹵水制作的泡菜,口感風(fēng)味較佳,但由于老鹵水需要長時(shí)間循環(huán)發(fā)酵獲得[7],且不同的老鹵制作的泡菜難以標(biāo)準(zhǔn)化,因此該傳統(tǒng)工藝很難應(yīng)用于工業(yè)化產(chǎn)業(yè)。本文以四川老鹵水泡菜為研究對(duì)象,研究其理化特征和風(fēng)味物質(zhì),并分離其特征乳酸菌菌群,為實(shí)現(xiàn)優(yōu)良菌株的有效利用奠定良好基礎(chǔ)。
老鹵泡菜:共8份,采集于四川省某泡菜廠,均為發(fā)酵辣椒,采自8個(gè)不同的發(fā)酵大壇(1 000 kg),編號(hào)為DT100、DT268、DT274、DT566、DT661、ZTC、XTC、TTC。
TaqDNA聚合酶mix,購于上海科晴生物科技有限公司;引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成;吡啶、核糖醇、甲氧胺鹽酸鹽、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺,均購于美國Sigma公司;硝酸銀、鉻酸鉀、硫酸、蒽酮、鹽酸等均為分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)、生化試劑BR(沃凱),購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母膏5 g/L,檸檬酸氫二銨2 g/L,乙酸鈉5 g/L,K2HPO42 g/L,MgSO40.58 g/L,硫酸錳0.25 g/L,吐溫80 1mL/L,pH 6.2~6.4。
SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái),蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司;MLS-3750型滅菌鍋,日本三洋公司;GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;T100型PCR儀,美國BioRad公司;全自動(dòng)凱氏定氮儀,濟(jì)南海能儀器股份有限公司;l?ser-om806m型冰點(diǎn)滲透壓測定儀,德國l?ser公司;Allegra 6R冷凍離心機(jī),德國貝克曼公司;氣質(zhì)聯(lián)用儀Thermo Trace 1310氣相色譜,美國Thermo公司;Thermo TSQ 8000 Evo質(zhì)譜,美國Thermo公司;冷凍高速離心機(jī),德國Eppendorf公司;pH計(jì),瑞士Mettler Toledo公司;冷凍濃縮離心干燥機(jī),美國Thermo公司。
1.5.1 四川泡菜理化特征測定
pH值測定:取25 g泡菜樣品,勻漿后采用8 000g離心5 min,采用pH計(jì)測定上清的pH值。
總酸含量測定:參考國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。
總糖含量測定:稱取5 g泡菜樣品勻漿后加入25 mL蒸餾水煮沸30 min,冷卻后過濾并定容至50 mL,取上清1 mL采用硫酸蒽酮法測定總糖含量。
總氮含量測定:稱取5 g泡菜樣品勻漿后加入25 mL蒸餾水煮沸30 min,冷卻后過濾并定容至50 mL,取上清5 mL利用凱氏定氮法測定總氮含量。
NaCl含量測定:取5 g泡菜樣品勻漿后定容至10 mL,取1 mL定容后的溶液進(jìn)行鹽含量測定,具體方法參照彭易濤[8]。
滲透壓測定:取5 g泡菜樣品于10 000×g離心10 min,取上清100 μL用超純水稀釋5倍后,取100 μL上清用滲透壓測定儀測定。
1.5.2 揮發(fā)性物質(zhì)測定
取5 g樣品裝入15 mL氣相瓶,同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)1 μL庚酸甲酯(20 mg/mL)。采用固相微萃取方法對(duì)泡菜進(jìn)行揮發(fā)性成分的提取。樣品于自動(dòng)萃取臺(tái)上50 ℃預(yù)平衡30 min,然后將萃取頭DVB/CAR/PDMS插入萃取瓶中50 ℃萃取30 min。在無分流模式下240 ℃解吸2 min。
揮發(fā)性物質(zhì)測定(GC-MS):(1)氣相色譜條件:RTX-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:氦氣;載氣線速度:35.0 cm/s;分流進(jìn)樣:1∶10;柱初溫40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升溫至130 ℃并保持5 min,以25 ℃/min升溫至155 ℃,以5 ℃/min升至220 ℃并保持5 min;進(jìn)樣口溫度:240 ℃。(2)質(zhì)譜條件:傳輸線溫度220 ℃;離子源溫度300 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z15~500。由GC-MS得到的譜圖,采用NIST 2001標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)進(jìn)行物質(zhì)定性。
1.5.3 非揮發(fā)性物質(zhì)測定
非揮發(fā)性物質(zhì)衍生化:稱取5 g泡菜樣品加入10 mL蒸餾水勻漿、過濾后,取汁液1 mL,采用10 000×g離心10 min后取上清液待用。取汁液1 mL常溫下10 000×g離心5 min,取50 μL上清液并加入15 μL 0.2 mg/mL核糖醇溶液作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。室溫冷凍濃縮離心干燥約2 h,待樣品水分揮發(fā)后進(jìn)行衍生化處理。加入30 μL 20 mg/mL甲氧基胺鹽酸鹽溶液37 ℃保溫90 min,然后加入90 μLN-甲基-N-(三甲基硅基)-三氟乙酞胺(CMSTFA)400 ℃保溫30 min,10 000×g離心5 min后待測。
非揮發(fā)性物質(zhì)測定:(1)氣相色譜條件:RTX-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:氦氣;載氣線速度:35.0 cm/s;分流比:1∶10;柱初溫70 ℃,以5 ℃/min升至230 ℃,以90 ℃/min升至320 ℃;進(jìn)樣口溫度240 ℃。(2)質(zhì)譜條件:傳輸線溫度280 ℃;離子源溫度300 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z33~600。由GC-MS得到的譜圖,采用NIST 2001標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)進(jìn)行物質(zhì)定性。
1.5.4 泡菜樣品菌落計(jì)數(shù)
采用MRS和PCA兩種培養(yǎng)基,對(duì)泡菜樣品分別進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)和菌落總數(shù)計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)方法按照《GB4789.35—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》和《GB4789.2—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》進(jìn)行。
1.5.5 泡菜樣品中乳酸菌的分離、菌落形態(tài)觀察及菌株16S rRNA鑒定
取25 g泡菜樣品,置于裝有225 mL無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)袋內(nèi),于無菌均質(zhì)器中拍打3 min,得10-1樣品勻液。然后,進(jìn)行10倍系列梯度稀釋,得10-2、10-3、10-4的樣品勻液。取0.1 mL稀釋度為10-1、10-2、10-3和10-4的樣品涂布在MRS培養(yǎng)基平板上,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。
將培養(yǎng)基上形態(tài)不同的單菌落分別編號(hào),觀察其菌落形態(tài)特征并做記錄與拍照。選取不同形態(tài)特征的菌株進(jìn)行劃線分離純化,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中上游引物27F:5′-AGAGTTTGATC-CTGGCCTCA-3′,下游引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′,擴(kuò)增片段為1500 bp左右,反應(yīng)體系(50 μL):模板,1 μL;上游引物27F(20 μmol/L),0.5 μL;下游引物1492R(20 μmol/L)0.5 μL;TaqDNA聚合酶mix,25 μL;雙蒸水,23 μL。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司完成測序;序列完成拼接并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì),確定待測細(xì)菌的種屬。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0分析處理,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用ANOVA進(jìn)行顯著性分析,顯著水平p<0.05,用不同字母表示;采用Origin 9.0軟件處理作圖,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3次。
乳酸菌可以利用蔬菜原料中的糖類作為碳源,經(jīng)過發(fā)酵生成乳酸、乙酸等有機(jī)酸,降低體系pH值,從而抑制腐敗菌和致病菌的生長,同時(shí)也可以改善泡菜的風(fēng)味和口感[9]。泡菜的發(fā)酵階段可根據(jù)pH值來劃分,在各發(fā)酵階段泡菜微生物組成和多樣性會(huì)隨著pH值的改變而變化[10]。
由表1可知,8份老鹵泡菜樣品的pH值均在4.0以下,且樣品間差異不顯著,平均pH值為3.59±0.22,與趙楠研究結(jié)果一致[5]。由總酸含量測定結(jié)果可以看出(表1),樣品DT100的總酸含量達(dá)到17.05 mg/g,顯著高于其他7份樣品(p<0.05);這7份泡菜樣品的總酸含量在10.78~13.01 mg/g,且差異不顯著(p>0.05)。根據(jù)泡菜標(biāo)準(zhǔn)《SB/T 10756—2012泡菜》規(guī)定,泡菜總酸含量(以乳酸計(jì))≤15 mg/g。樣品DT100的總酸含量已經(jīng)超標(biāo),而其他7份樣品的總酸含量也較高,這可能是由老鹵水多次循環(huán)使用造成的。
表1 老鹵泡菜的pH值和總酸含量Table 1 The pH and total acid content in old brined Paocai
注:不同字母代表同一指標(biāo)不同樣品之間存在顯著性差異(p<0.05)。
傳統(tǒng)四川泡菜在制作過程中常加入白砂糖來調(diào)節(jié)泡菜的口感,加入的白砂糖也會(huì)被乳酸菌利用,促進(jìn)其迅速生長。泡菜制作過程中,蔬菜中的一些碳水化合物也會(huì)溶出,被微生物利用。蘇揚(yáng)等對(duì)泡菜的風(fēng)味化學(xué)及呈味機(jī)理進(jìn)行了探討,經(jīng)過微生物發(fā)酵后,蔬菜組織內(nèi)的糖含量降低,而總酸含量增加[11]。如表2所示,8份泡菜樣品的平均總糖含量為31.17 mg/g,其中DT100、DT274、DT566和DT661 4份樣品中總糖含量較低,均在25 mg/g左右,ZTC樣品中總糖含量最高,達(dá)到47.08 mg/g。
表2 老鹵泡菜的總糖含量、總氮含量和NaCl含量Table 2 The total sugar content, total nitrogen content and total sodium chloride in old brined Paocai
注:不同字母代表同一指標(biāo)不同樣品之間存在顯著性差異(p<0.05)。
蔬菜中含有糖類、肽、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì),這些營養(yǎng)物質(zhì)可以通過滲透作用進(jìn)入泡菜鹵[12],并被微生物利用,所以泡菜發(fā)酵過程中總氨基氮含量降低。如表2所示,8份泡菜樣品的總氮含量均比較低,平均含量為0.17 g/100 g,其中,DT100總氮含量最低,為0.04 g/100g,DT274總氮含量最高,為0.26 g/100 g。趙楠測定了50份四川泡菜樣品,其總氮含量平均值為0.16 g/100 g[5],與本研究結(jié)果一致。鹽水泡漬處理不僅直接影響泡菜的咸味,還能影響泡菜的微生物群落結(jié)構(gòu),從而進(jìn)一步影響泡菜的質(zhì)量和風(fēng)味[13]。傳統(tǒng)的泡菜鹽度在2%~8%,趙楠研究了50份四川泡菜樣品,其鹽度平均值為7.02 g/100 g[5]。本研究檢測的8份泡菜樣品,鹽度平均值為4.46 g/100 g,其中DT100、DT268、DT274、DT566和DT661樣品的鹽度較高,在5.35~6.43 g/100 g,而ZTC、XTC和TTC 3個(gè)樣品的鹽度較低,在1.17~2.90 g/100 g。
食鹽、可溶性糖、有機(jī)酸以及其他可溶性物質(zhì),共同使泡菜具有一定的滲透壓,高的滲透壓會(huì)抑制腐敗菌的生長,有利于泡菜的保藏。由表2可知,不同泡菜樣品的滲透壓差異顯著,滲透壓與泡菜的NaCl含量具有正相關(guān)性,NaCl含量高,則具有較高的滲透壓。由表2可知,DT661的滲透壓最高,為2 238 mOsm/kg,ZTC的滲透壓最低,為434 mOsm/kg。
特征風(fēng)味物質(zhì)包括揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)。揮發(fā)性物質(zhì)通常代表的是香味物質(zhì),是感官評(píng)定中香味指標(biāo)的量化;非揮發(fā)性物質(zhì)通常代表的是滋味物質(zhì),是感官評(píng)定中口感指標(biāo)的量化。為了明確老鹵泡菜中的風(fēng)味物質(zhì)的組成,對(duì)采集樣品的揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測。
2.3.1 老鹵泡菜揮發(fā)性物質(zhì)測定
經(jīng)過GC-MS分析,8個(gè)泡菜樣品中共檢出54種揮發(fā)性化合物,其中包括烷烴21種、酯類13種、醇類7種、酚類2種、呋喃2種、醚類2種、醛類化合物1種、吡喃類化合物1種、硫化物1種、脲類1種、酸類1種、萜類1種和酮類1種。老鹵泡菜的主要揮發(fā)性物質(zhì)是烷烴、酯類等具有水果香味的物質(zhì),如圖1所示。
1-甲基環(huán)戊烷;2-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3醇丙酸酯;3-檸檬烯;4-乙酸乙酯;5-6,6-二甲基雙環(huán)[3.1.1]庚烷;6-環(huán)己烷;7-1,3-雙(1,1-亞甲基乙基)-苯;8-1-甲氧基-4-丙烯基氧-苯;9-庚酸乙酯;10-2-甲基-1-丁醇圖1 老鹵泡菜中的主要揮發(fā)性物質(zhì)Fig.1 The major volatile compounds in old brined Paocai
主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有10種,包括甲基環(huán)戊烷、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3醇丙酸酯、檸檬烯、乙酸乙酯、6,6-二甲基雙環(huán)[3.1.1]庚烷、環(huán)己烷、1,3-雙(1,1-亞甲基乙基)-苯、1-甲氧基-4-丙烯基氧-苯、庚酸乙酯和2-甲基-1-丁醇。圖1反映了每種風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量在8個(gè)樣品中的離散程度,可以看出不同樣品中風(fēng)味物質(zhì)的含量差異較大。陳功等[14]研究發(fā)現(xiàn),四川泡菜的主體風(fēng)味物質(zhì)為二甲基硫化物、烯類和醛類,酯類含量較少,與本研究結(jié)果差異較大。周相玲等[15]發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵大白菜中的主要風(fēng)味物質(zhì)為二甲基二硫、二烯丙基硫醚和3-甲硫基丙烯。而這些風(fēng)味物質(zhì)的差異,是由發(fā)酵原料、乳酸菌發(fā)酵和酵母菌發(fā)酵等共同造成的。
2.3.2 老鹵泡菜非揮發(fā)性物質(zhì)測定
經(jīng)過GC-MS分析,8個(gè)泡菜樣品中共檢出70種非揮發(fā)性化合物,其中包括有機(jī)酸類化合物18種、氨基酸類化合物15種、醇類化合物10種、糖類化合物8種、胺類化合物5種、烷烴類化合物6種并且檢出少量種類的硫化物、酚、脲、醛、酯等物質(zhì)。除乳酸外,相對(duì)含量在1%以上的物質(zhì)共有18種(圖2),包括丙二醇、甘油、琥珀酸、草酸、甘露醇、磷酸、1-去甲基(2β, 3β)-蠟梅堿、葡萄糖、甘氨酸、3-氧雜-4-羥基-4-烯-2-辛亞胺、軟脂酸、赤蘚糖醇、γ-氨基丁酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、丙二酸和果糖。其中,丙二醇的含量最高,在17.30%。周相玲等[15]在自然發(fā)酵的泡菜中檢測到了酒石酸、乳酸、乙酸和琥珀酸等多種有機(jī)酸,陳卓等[16]在自然發(fā)酵泡菜中檢測到了草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸6種有機(jī)酸。
1-丙二醇;2-甘油;3-琥珀酸; 4-草酸;5-甘露醇;6-磷酸;7-1-去甲基(2β, 3β)-蠟梅堿;8-葡萄糖;9-甘氨酸;10-3-氧雜-4-羥基-4-烯-2-辛亞胺;11-軟脂酸;12-赤蘚糖醇;13-γ-氨基丁酸;14-亮氨酸;15-纈氨酸;16-異亮氨酸;17-丙二酸;18-果糖圖2 老鹵泡菜中主要的非揮發(fā)性物質(zhì)Fig.2 The major non-volatile compounds in old brined Paocai
值得一提的是,四川老鹵泡菜中甘露醇和γ-氨基丁酸的含量較高。甘露醇由微生物代謝果糖產(chǎn)生,具有一定甜味并帶有清爽感[17]。γ-氨基丁酸是一種動(dòng)物、人體內(nèi)具有生理調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)[18],老鹵水循環(huán)使用不僅積累了風(fēng)味物質(zhì),也積累了一些活性物質(zhì),從而提高了泡菜的營養(yǎng)價(jià)值。
2.4.1 老鹵泡菜微生物數(shù)量
由表3可知,不同泡菜樣品中乳酸菌數(shù)差異較大,在1.0×102~2.8×105CFU/g。通常來講,同一樣品的細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)該不小于乳酸菌總數(shù),比較MRS和PCA兩種培養(yǎng)基的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DT100、DT268、DT566、DT661、XTC和TTC樣品中乳酸菌總數(shù)與細(xì)菌總數(shù)接近,表明泡菜中的細(xì)菌主要為乳酸菌。DT274和ZTC樣品中細(xì)菌總數(shù)高于乳酸菌總數(shù),表明2份泡菜中除了乳酸菌以外,還有其他微生物增殖。
表3 老鹵泡菜的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果Table 3 Colony counting results of old brined Paocai
注:不同字母代表同一樣品MRS和PCA 2種培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)結(jié)果的顯著性差異。
2.4.2 老鹵泡菜特征乳酸菌的分離與鑒定
根據(jù)泡菜的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果,選用MRS培養(yǎng)基來分離乳酸菌。根據(jù)培養(yǎng)基中的菌落形態(tài),從大小、表面觀、邊緣觀、側(cè)面觀4個(gè)方面對(duì)菌落進(jìn)行觀察,最終挑選出36株菌進(jìn)行16S rRNA鑒定,菌株編號(hào)及鑒定結(jié)果見表4。
表4 菌株序列比對(duì)結(jié)果Table 4 Sequence results of strains
續(xù)表4
四川泡菜制作依賴?yán)消u泡制,該文對(duì)8份老鹵泡菜樣品的理化指標(biāo)進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)老鹵泡菜的pH值平均為3.59±0.22,總酸含量平均為(12.47±1.97) mg/g,總糖含量平均為(31.17±9.76) mg/g,NaCl含量平均為(4.46±2.17) g/100 g,總氮含量平均為(0.17±0.07) g/100 g,滲透壓在434~2 238 mOsm/kg。
經(jīng)過GC-MS分析,老鹵泡菜中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是烷烴和酯類,包括甲基環(huán)戊烷、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3醇丙酸酯、檸檬烯、乙酸乙酯等;主要的非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)包括乳酸、丙二醇、甘油、琥珀酸、草酸、甘露醇、γ-氨基丁酸、丙二酸和果糖等,其中甘露醇和γ-氨基丁酸是主要的活性物質(zhì)。
從8份老鹵泡菜樣品成功分離到植物乳桿菌、布氏乳桿菌和耐乙醇片球菌3種乳酸菌,是老鹵泡菜的優(yōu)勢和特征菌群,在泡菜發(fā)酵過程具有重要的作用。