裂殖壺菌制備二十二碳六烯酸油脂的研究歷程及發(fā)展前景

胡學(xué)超，任路靜，胡耀池，紀(jì)曉俊，黃和

(南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京，211816)

二十二碳六烯酸(decosahexaeonic acid,DHA)是一種重要的ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)腦細(xì)胞發(fā)育，降血脂，保護(hù)視力，抗癌，提高免疫力等重要生理功能[1]，廣泛應(yīng)用在嬰幼兒食品及醫(yī)藥行業(yè)。世界衛(wèi)生組織早在1994年就規(guī)定嬰幼兒奶粉中必須添加DHA，市場(chǎng)需求量大。

傳統(tǒng)的DHA生產(chǎn)原料主要來源于魚油，但魚的種類、季節(jié)、地理位置等因素的差異造成了油含量和油中不飽和脂肪酸含量的不穩(wěn)定；魚油提取獲得的DHA含有大量的EPA(eicosapetaenoic acid, 22∶5)，腥味大，且DHA初始含量低，約為10%～20%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于使用要求(35%)，因此需要將魚油中的DHA純化以提高含量。天然的DHA為甘油三酯型，沸點(diǎn)較高，目前最常用的方法是利用甲醇或乙醇進(jìn)行置換，形成甲酯或乙酯型DHA，沸點(diǎn)降低后提純[2]，但甲酯或乙酯型DHA的人體吸收率相對(duì)于甘油酯型DHA低；再加上魚油來源日漸緊缺，難以實(shí)現(xiàn)此種高價(jià)值產(chǎn)品在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的廣泛應(yīng)用。為滿足DHA不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，近年來，科學(xué)工作者開展了利用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA的研究。常用的微生物包括隱甲藻 (Cryptheconidiumcohnii)、裂殖壺菌 (Schizochytriumsp.)、吾肯氏藻(Ulkeniaamoeboida)等，裂殖壺菌因其生長(zhǎng)速度快、油含量高、DHA比例高，是當(dāng)前DHA產(chǎn)業(yè)化的主要生產(chǎn)菌。本文主要針對(duì)生物制備DHA的過程進(jìn)行綜述，以裂殖壺菌為重點(diǎn)，從菌種特性、安全性認(rèn)證、發(fā)酵水平提升、油脂精煉技術(shù)的革新等角度論述生物法制備DHA油脂的研究歷程及發(fā)展前景。

1 DHA的生產(chǎn)菌

1.1 隱甲藻

隱甲藻是一種生活在海洋，沒有葉綠素，不能進(jìn)行自養(yǎng)的雙鞭毛甲藻，在腐敗的大型褐藻及海藻上易于生長(zhǎng)繁殖[3]。隱甲藻的分類地位屬于Eukaryota域，Protozoa界，Dinophyta門，Dinophyceae綱，Peridiniales目，Crypthecodiniaceae科，Crypthecodinium屬的一類橢球形單細(xì)胞海洋微生物。早在1968年HARRINGTON[4]首次發(fā)現(xiàn)隱甲藻產(chǎn)DHA的能力后，BEACH等進(jìn)行了培養(yǎng)條件和環(huán)境方面的優(yōu)化來提高其生產(chǎn)能力。1994年，KYLE等[5]取得了較好的結(jié)果，培養(yǎng)60～90 h生物量可達(dá)40 g/L，藻種含油量為15%～30%，DHA占總脂肪酸的20%～35%，隨后在美國(guó)Martek公司實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，創(chuàng)建了Life’s DHA品牌，并在世界范圍內(nèi)進(jìn)行銷售。以de Swaaf代表的荷蘭農(nóng)業(yè)研究所團(tuán)隊(duì)在21世紀(jì)初開發(fā)了除葡萄糖外以乙酸[6]、乙醇[7]為底物對(duì)C.cohniiATCC 30772進(jìn)行培養(yǎng)的研究，最高細(xì)胞干重達(dá)109 g/L，總脂含量61 g/L，DHA含量19 g/L，為至今為止隱甲藻生產(chǎn)DHA報(bào)道的最高產(chǎn)量。

1.2 裂殖壺菌

由于隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA周期長(zhǎng)，產(chǎn)率不高，且生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用被美國(guó)Martek公司壟斷，人們將目光轉(zhuǎn)向了海洋真菌——破囊壺菌和裂殖壺菌。裂殖壺菌又稱裂壺藻，屬于真菌門(Eumycota)、卵菌綱(Oomycetes)、水霉目(Saprolegniales)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)的一類海洋真菌，單細(xì)胞、球形[8]。1964年，HASKINS等人[9]報(bào)道，破囊壺菌Traustochytriumaureum總脂中含有高達(dá)34%的DHA，揭示了破囊壺菌屬微生物產(chǎn)DHA的能力。隨后的研究多集中在不同海域中菌種的篩選和培養(yǎng)條件的改進(jìn)方面。如1990年WILLIAM[10]等也在海水中篩選出一系列破囊壺菌菌屬的裂殖壺菌和破囊壺菌菌株，經(jīng)工藝優(yōu)化后被應(yīng)用于Omega Tech公司的后續(xù)生產(chǎn)中；1996年NAKAHARA等[11]從日本Yap群島珊瑚礁附近海水分離到1株裂殖壺菌Schizochytriumsp. SR21，培養(yǎng)56 h，生物量即可達(dá)到21 g/L，DHA產(chǎn)量高達(dá)4.7 g/L，隨后為Sundory公司所用。我國(guó)研究者也陸續(xù)在中國(guó)海域篩選獲得了多株裂殖壺菌菌株等，如本團(tuán)隊(duì)所篩選的Schizochytriumsp. HX-308[12]，中國(guó)海洋大學(xué)的OUC88[13]等，為國(guó)內(nèi)DHA產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1.3 不同DHA生產(chǎn)菌的生產(chǎn)能力差異

除隱甲藻和裂殖壺菌外，破囊壺菌、吾肯氏藻等菌株也可生產(chǎn)DHA。不同菌種生產(chǎn)的DHA其脂肪酸組分和生產(chǎn)能力不同。隱甲藻生產(chǎn)的DHA油脂中C14∶0(月桂酸)含量較高，但不含有DPA(二十二碳五烯酸，ω-6)，而海洋真菌中C16∶0(軟脂酸)含量較高，含有DPA。

2 微生物來源DHA的安全性認(rèn)證

2.1 安全性認(rèn)證

作為嬰幼兒食品的DHA油脂，安全性至關(guān)重要。世界各國(guó)對(duì)于DHA油脂的安全性認(rèn)證主要集中在3種菌，隱甲藻、裂殖壺菌和吾肯氏藻(Ulkeniasp.)。所有的認(rèn)證都是以公司產(chǎn)品為主，在某個(gè)國(guó)家申請(qǐng)新資源認(rèn)證，證明其可以通過安全性評(píng)價(jià)而作為食品添加劑應(yīng)用在某些特定的領(lǐng)域。最早的安全認(rèn)證來自美國(guó)馬泰克。2000年，其對(duì)2個(gè)主打產(chǎn)品DHASCO和ARASCO在美國(guó)提出GRAS認(rèn)證，明確指明DHASCO由隱甲藻生產(chǎn)，ARASCO由高山被孢霉生產(chǎn)。而裂殖壺菌的安全認(rèn)證經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的歷史，直至2010年我國(guó)衛(wèi)生部才頒布相關(guān)條文批準(zhǔn)來源于雙鞭甲藻、裂殖壺菌、吾肯氏藻的DHA藻油可作為新資源食品，添加到食品中，此類規(guī)定的出臺(tái)是國(guó)內(nèi)DHA產(chǎn)業(yè)的重要里程碑，促進(jìn)了國(guó)內(nèi)DHA產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。隨后，2011年，GB24600—2011關(guān)于二十二碳六烯酸油脂(發(fā)酵法)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)正式出臺(tái)，預(yù)示著發(fā)酵法生產(chǎn)DHA產(chǎn)業(yè)的規(guī)范化程度日漸成熟。此外，近年來國(guó)內(nèi)也出現(xiàn)了多個(gè)DHA的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，如《DHA藻油》、《DHA微囊粉》等，這些行標(biāo)主要對(duì)產(chǎn)品某些特殊的指標(biāo)又進(jìn)行了限定。而對(duì)于吾肯氏藻的安全性認(rèn)證，由Nutrinva公司2004年提出申請(qǐng)，最終也通過了美國(guó)GRAS認(rèn)證。

2.2 DHA應(yīng)用的法律法規(guī)

國(guó)內(nèi)外權(quán)威部門對(duì)DHA的使用量做出了明確的規(guī)定。1994年，世界衛(wèi)生組織推薦每天嬰幼兒每公斤體重應(yīng)該補(bǔ)充20 mg DHA，早產(chǎn)嬰兒每天每公斤體重補(bǔ)充40 mg DHA；國(guó)際脂肪酸和類脂研究學(xué)會(huì)(ISSFAL)指出：妊娠和哺乳期婦女每天補(bǔ)充300 mg DHA，歐盟相關(guān)組織也做出類似規(guī)定，指出妊娠和哺乳期婦女每天至少補(bǔ)充200 mg DHA[14]。在我國(guó)，衛(wèi)生部在2003年食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)增補(bǔ)品種中，首次將二十二碳六烯酸單細(xì)胞油(DHASCO)作為營(yíng)養(yǎng)素強(qiáng)化劑添加到嬰幼兒食品中(添加量在0.09%～0.15%)。2004年在《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB—2760)2004年增補(bǔ)內(nèi)容中將添加量增加到10～126 mg/100g。2006年在衛(wèi)生部公告第12號(hào)文件中將DHA的添加量增加到30～100 mg/100g，以上法規(guī)的出臺(tái)也使得DHA的使用更加規(guī)范。

3 裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA的研究概況

3.1 發(fā)酵水平

生產(chǎn)效率的提高是實(shí)現(xiàn)裂殖壺菌規(guī)?；苽銬HA產(chǎn)業(yè)化的前提，評(píng)價(jià)DHA發(fā)酵的主要指標(biāo)包括生物量、油脂產(chǎn)量、DHA占總油脂的百分比。圍繞裂殖壺菌發(fā)酵水平的提升，國(guó)內(nèi)外研究主要集中在菌種性能提升、發(fā)酵過程調(diào)控和規(guī)?；糯?個(gè)方面。

表1 裂殖壺菌發(fā)酵水平提升常用的研究策略Table 1 Common research strategies for the improvementof DHA production

在菌種提升方面，誘變育種和菌種馴化是2個(gè)主要的研究策略。練敏等[15]提出了利用丙二酸限制三羧酸循環(huán)的分流、碘乙酸抑制3-磷酸甘油脫氫酶的定向菌種選育方法，提升檸檬酸從線粒體向胞漿的分流和磷酸戊糖途徑的通量，獲得了多株高油脂含量生產(chǎn)菌株，其中DHA產(chǎn)量較原始菌提高了35%，油脂含量達(dá)到38.6 g/L。除此之外，乙酰輔酶A羧化酶催化乙酰CoA生成丙二酰CoA，而喹禾靈是乙酰輔酶A羧化酶的抑制劑。許永等[16]采用紫外誘變和喹禾靈反向篩選高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌，生物量和DHA含量分別提高了11.57%和28.75%。FU等[17]利用低能離子束誘變結(jié)合蘇丹黑染色的方法進(jìn)行篩選，DHA產(chǎn)量提高了60%。此外，微生物的適應(yīng)性進(jìn)化，又稱菌種馴化，是目前備受矚目的菌種改良技術(shù)，通過長(zhǎng)期將微生物培養(yǎng)在脅迫環(huán)境中，在較短時(shí)間內(nèi)有效地改變菌株的某些表型或者生理特性。孫小曼等[18]開發(fā)了不同環(huán)境刺激的裂殖壺菌馴化技術(shù)，利用高供氧(攪拌轉(zhuǎn)速230 r/min)連續(xù)馴化菌種的方法，迫使細(xì)胞長(zhǎng)期處于氧化損傷狀態(tài)，改變了裂殖壺菌的氧適應(yīng)性，在高供氧下也能保證高的DHA含量，同時(shí)角鯊烯含量降低了63%。采用高滲和低溫雙脅迫馴化技術(shù)[19]，也可提升裂殖壺菌的產(chǎn)油能力和菌種的抗氧化脅迫能力。

在發(fā)酵調(diào)控方面，高密度發(fā)酵、油脂含量的提高、DHA占油脂比例的提升是研究的關(guān)鍵。高密度發(fā)酵是胞內(nèi)產(chǎn)物高效積累的前提，分批補(bǔ)料發(fā)酵可以緩解高濃度底物的抑制作用，提高生產(chǎn)效率，分批補(bǔ)加碳源是常規(guī)手段。QU等[20]探究了不同補(bǔ)料方式對(duì)DHA產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)反復(fù)分批補(bǔ)料效果最佳。LING等[21]創(chuàng)新性地采用氮源補(bǔ)加策略將細(xì)胞干重進(jìn)一步提高了1倍。其次，營(yíng)養(yǎng)限制和環(huán)境刺激是油脂積累的調(diào)控點(diǎn)，但細(xì)胞的快速增殖又需要豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和良好的環(huán)境條件，因此雙階段的發(fā)酵調(diào)控工藝在DHA生產(chǎn)中較為普遍，如雙階段控溫[22]既可以保證高的細(xì)胞生長(zhǎng)速率又可以增加不飽和脂肪酸的比例，多階段氧供應(yīng)[23]可解決生長(zhǎng)的高氧需求和低氧消耗，雙階段滲透壓[24]可利用種子階段高滲刺激分裂、發(fā)酵階段低滲促進(jìn)油脂積累提高油脂產(chǎn)率。此外，DHA合成的代謝途徑需要大量的ATP、NADPH、乙酰輔酶A等輔因子的參與，小分子添加也是常用的研究手段。本研究團(tuán)隊(duì)[25]通過在發(fā)酵過程中添加蘋果酸和乙酸鈉的方法提高裂殖壺菌的NADPH和乙酰CoA供應(yīng)，其中油DHA含量提高至60%；通過添加抗環(huán)血酸鈉[26]緩解發(fā)酵過程中的氧化損傷，胞內(nèi)ROS降低了35%，DHA含量提高了44%。另外，考慮到裂殖壺菌的微藻屬性，一些植物激素如茉莉酸、萘氧基乙酸也用來調(diào)控裂殖壺菌的生長(zhǎng)，提高油脂產(chǎn)率[27]。

在規(guī)模化放大方面，如何做到大規(guī)模發(fā)酵罐的精準(zhǔn)放大并穩(wěn)定生產(chǎn)是關(guān)鍵。瞿亮等[28]通過逐級(jí)放大的方法，建立了裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA的過程放大經(jīng)驗(yàn)方程，基于經(jīng)驗(yàn)方程設(shè)定大規(guī)模發(fā)酵罐下的工藝參數(shù)，發(fā)酵規(guī)模從10 L放大到7 t。在DHA生產(chǎn)穩(wěn)定控制方面，郭東升等[29]研究了不同氧環(huán)境下DHA發(fā)酵過程中呼吸商RQ、氧氣吸收速率OUR、二氧化碳釋放速率CER的變化規(guī)律，提出OUR可以作為DHA生產(chǎn)過程中的精準(zhǔn)控制指標(biāo)，比溶氧DO有更好的指導(dǎo)意義。由于DHA發(fā)酵的高需氧性，DHA的發(fā)酵通常在多層槳葉生物反應(yīng)器中進(jìn)行，此類反應(yīng)器中，攪拌槳的改變對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響至關(guān)重要。趙曉艷等[30]結(jié)合CFD模擬技術(shù)研究了3種不同攪拌槳組合對(duì)反應(yīng)器流場(chǎng)和DHA產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)直葉、箭葉、直葉的徑向流式攪拌槳組合混合效果較好，且能獲得較高的DHA產(chǎn)量。此外，近年來一些新型反應(yīng)器，如膜曝氣生物反應(yīng)器[31]、通氣強(qiáng)化膜反應(yīng)器[32]等也應(yīng)用到DHA的生產(chǎn)中，其中利用膜曝氣生物反應(yīng)器，DHA發(fā)酵的細(xì)胞密度達(dá)到了151 g/L以上，油脂占細(xì)胞干重達(dá)到了68%，生產(chǎn)效率提高了83.77%。

3.2 裂殖壺菌合成DHA特殊的代謝途徑

傳統(tǒng)的多不飽和脂肪酸合成是在線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上通過脂肪酸延長(zhǎng)酶和脂肪酸去飽和酶進(jìn)行碳鏈延伸和雙鍵引入。但該途徑需要多種延長(zhǎng)酶和去飽和酶的參與，伴隨著多種中間副產(chǎn)物的積累。除了這種常規(guī)合成途徑外，JAMES等[33]在 Science期刊上首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道裂殖壺菌還存在一種類似迭代型聚酮合酶的復(fù)合酶催化合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。近年來，人們也陸續(xù)在自然界發(fā)現(xiàn)多種催化不同多不飽和脂肪酸合成的迭代型聚酮合酶[34]，并將此類利用聚酮合酶合成的脂肪酸定義為次級(jí)脂質(zhì)，將此類基因簇稱之為脂肪酸聚酮合酶(FAS/PKS )基因簇[35]。脂肪酸聚酮合酶(FAS/PKS)包括β-酮酰合成酶(KS)、β-酮酰-ACP還原酶(KR)、烯酰還原酶(ER)、脫水酶/異構(gòu)酶(DH/I)、?；D(zhuǎn)移酶(AT)和酰基載體蛋白(ACP)等功能模塊。類似于經(jīng)典的脂肪酸合成酶催化過程，該酶以乙酰 ACP 為起始單元，以丙酰 ACP 為延伸單元，通過 KS、KR、DH、ER功能域的循環(huán)延伸碳鏈，但脂肪酸聚酮合酶會(huì)選擇性的缺失最后一步?；€原(ER )步驟而在脂肪酸鏈中引入雙鍵[36]。對(duì)于DHA的合成，脂肪酸聚酮合酶需要引入6個(gè)雙鍵，但是目前對(duì)于該酶引入雙鍵的時(shí)機(jī)和次數(shù)控制機(jī)制仍然不夠清晰。脂肪酸聚酮合酶途徑可直接從頭合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸產(chǎn)品，與傳統(tǒng)的延長(zhǎng)去飽和途徑相比，具有更高的能量利用效率。以DHA為例，延長(zhǎng)去飽和途徑需要26個(gè)NADPH，聚酮合酶途徑僅需要14個(gè)，因此，裂殖壺菌胞內(nèi)這種特殊的不飽和脂肪酸合成途徑具有更大的改造空間和應(yīng)用價(jià)值。

圖1 脂肪酸聚酮合酶催化合成不飽和脂肪酸的過程Fig.1 Polyunsaturated fatty acid biosynthesis catalysed by PUFA-PKS synthase

4 DHA油脂的提煉工藝

油脂為胞內(nèi)產(chǎn)物，細(xì)胞破碎是油脂提取的前提，目前已報(bào)道的細(xì)胞破碎方法有多種，主要分為物理法(微波法、超聲法、均質(zhì)法等)、化學(xué)法(酸熱法、堿法等)及生物法(酶法等)[37-39]。在DHA產(chǎn)業(yè)發(fā)展初期，均質(zhì)法是工業(yè)上最常用的細(xì)胞破碎方法，但其能耗高，操作復(fù)雜，所需人力多。后續(xù)人們開發(fā)了酶法破碎工藝，篩選不同的酶進(jìn)行破碎，該方法可直接在發(fā)酵罐中進(jìn)行，無需增加設(shè)備，破碎效率比機(jī)械破碎高。一般來講，酶法提取主要利用蛋白酶進(jìn)行破碎細(xì)胞，用量少，約為發(fā)酵液質(zhì)量的0.1%～0.2%，每噸發(fā)酵液的處理成本約為100元左右。對(duì)于油脂的提取，溶劑提取是常規(guī)手段，溶劑的使用和回收使得提取工段的設(shè)備投入和成本巨大，同時(shí)也給生產(chǎn)過程帶來巨大的安全隱患，生產(chǎn)車間也需要防爆。近年來，無溶劑提取工藝[40]逐漸應(yīng)用到裂殖壺菌的油脂提取過程(如圖2)，該工藝操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率大大提升。DHA毛油一般通過脫膠、堿煉、脫色、脫臭等工序，除去油脂中的蛋白膠質(zhì)、皂角、色素和氣味性物質(zhì)，最終獲得DHA精油。

圖2 機(jī)械破碎溶劑法與酶法無溶劑油脂提取工藝比較Fig.2 Comparison of lipid extraction process between mechanical crushing-solvent method and enzymatic free solvent method

5 發(fā)展前景

隨著社會(huì)各界對(duì)嬰幼兒健康的關(guān)注，以及中國(guó)逐步進(jìn)入老齡化社會(huì)，國(guó)民的健康需求不斷增長(zhǎng)，DHA在營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑領(lǐng)域的應(yīng)用將繼續(xù)擴(kuò)大。DHA藻粉還可作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用在養(yǎng)殖業(yè)，如利用DHA藻粉飼養(yǎng)禽類，獲得富含DHA的雞蛋，雞蛋中DHA存在于磷脂中，人體吸收率高達(dá)100%，還可應(yīng)用于高檔魚蝦類的養(yǎng)殖，前景廣闊。此外，目前DHA油脂含量一般在50%以上，更高DHA含量的產(chǎn)品開發(fā)也將推進(jìn)其在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用。魚油2015年需求量達(dá)到10.9億t，全球市場(chǎng)達(dá)到110億美元，進(jìn)一步降低藻油價(jià)格，加快藻油DHA產(chǎn)品的國(guó)外認(rèn)證，開發(fā)既含DHA又含EPA的藻油產(chǎn)品，替代部分魚油，也具有重要的推廣意義。

此外，裂殖壺菌生物量可達(dá)到200 g/L，油脂含量占60%以上，且具有獨(dú)立的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸合成系統(tǒng)，是極具潛力的微生物油脂加工廠。近年來，隨著裂殖壺菌全基因組測(cè)序、胞內(nèi)代謝機(jī)制的解析以及裂殖壺菌遺傳操作體系的建立，在裂殖壺菌中構(gòu)建其他脂質(zhì)化學(xué)品的代謝途徑，有望推進(jìn)更多的脂溶性營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品的開發(fā)。