葡萄KEA家族基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析

王壯偉，王慶蓮，夏瑾，王西成，宋志忠,2，吳偉民

?

葡萄KEA家族基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析

王壯偉1，王慶蓮1，夏瑾1，王西成1，宋志忠1,2，吳偉民1

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264025）

【目的】從葡萄中克隆并鑒定KEA家族基因，在轉(zhuǎn)錄水平探索其組織特異性表達(dá)特征及對(duì)缺鉀、脫落酸（ABA）、氯化鈉（NaCl）與山梨糖醇（sorbitol）等脅迫的響應(yīng)情況，明確主效基因?！痉椒ā客ㄟ^同源克隆法，在葡萄基因組中篩選并鑒定KEA家族基因；利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法建立9種不同植物（葡萄、擬南芥、水稻、玉米、高粱、短柄草、白楊、梨和蘋果）KEA家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹；借助多種生物信息學(xué)軟件分析葡萄KEA家族基因及其編碼蛋白的詳細(xì)特征；檢索EST數(shù)據(jù)庫，分析葡萄KEA家族基因的表達(dá)譜；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析KEA家族基因在葡萄不同組織部位的表達(dá)模式及對(duì)缺鉀、ABA、NaCl與sorbitol等脅迫的響應(yīng)情況，明確主效基因?！窘Y(jié)果】在葡萄基因組中檢索并克隆獲得4個(gè)KEA家族基因，命名為，均含有典型的K/H交換結(jié)構(gòu)域（K/H exchanger domain）和TrkA-N domain功能結(jié)構(gòu)域，屬于典型的植物K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體；9種不同植物的KEA家族蛋白在氨基酸水平具有33.10%的一致性，并可分為2個(gè)亞族（GroupⅠ和GroupⅡ），其中，葡萄VvKEA1和VvKEA2屬于GroupⅠ，均含有7個(gè)Motif基序，而VvKEA3和VvKEA4屬于GroupⅡ，只含有4個(gè)Motif基序；系統(tǒng)進(jìn)化樹表明葡萄VvKEA1、VvKEA2和VvKEA4成員分別與擬南芥AtKEA2、AtKEA3和AtKEA5緊密聚在一起，而葡萄VvKEA3則與梨PbrKEA5和蘋果MdoKEA7緊密聚在一起，水稻、玉米、高粱和短柄草4種禾本科植物KEA家族成員更傾向于聚在一起，而木本植物白楊、蘋果、梨KEA家族成員緊密聚在一起；葡萄KEA家族蛋白擁有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜，均含有12—13個(gè)跨膜區(qū)，均為穩(wěn)定蛋白，等電點(diǎn)均小于7.00，且只有VvKEA3具有信號(hào)肽；在葡萄啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到至少15種的順式作用元件，主要包括脅迫響應(yīng)、營養(yǎng)和發(fā)育、激素響應(yīng)、晝夜規(guī)律等不同生命活動(dòng)相關(guān)的調(diào)控元件；EST表達(dá)譜結(jié)果表明葡萄KEA家族基因在多種組織或器官中均有表達(dá)，在果實(shí)中的表達(dá)水平最高，其次是葉、種子、根和雌蕊；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明在8年生‘白羅莎里奧’葡萄樹不同組織中的整體表達(dá)水平最高，在幼果中的表達(dá)量最為突出，而其他3個(gè)的整體表達(dá)水平相對(duì)較低，且較為接近；幼苗中，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)NaCl處理沒有響應(yīng)，但對(duì)ABA處理最為敏感，的表達(dá)量在檢測幼苗的地上部和根部均被顯著誘導(dǎo)，在檢測幼苗的地上部和根部及在地上部的表達(dá)量受缺鉀處理誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)，在檢測幼苗的地上部和根部及在根部的表達(dá)量受sorbitol滲透處理誘導(dǎo)而顯著上升?！窘Y(jié)論】從葡萄中克隆并鑒定了4個(gè)KEA家族基因，主要在葡萄果實(shí)、葉片和種子中表達(dá)，其成員與擬南芥KEA成員在遺傳距離上較近；在成年葡萄樹中的整體表達(dá)水平最為豐富（幼果中最高），幼苗中受缺鉀、ABA和sorbitol滲透脅迫的調(diào)控；VvKEA3是葡萄果實(shí)中重要的K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體。

葡萄；K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體；生物信息學(xué)；脅迫處理

0 引言

【研究意義】鉀素營養(yǎng)與果樹生長、花開放及果實(shí)發(fā)育密切相關(guān)，但其分子基礎(chǔ)研究報(bào)道鮮少。鉀離子（K+）是植物細(xì)胞中含量最為豐富的陽離子之一，維持細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)平衡，控制細(xì)胞的基礎(chǔ)膜電位水平，在氣孔運(yùn)動(dòng)、光合作用、蒸騰作用、信號(hào)傳導(dǎo)和脅迫抗逆等生命過程中均起著至關(guān)重要的作用[1-2]。由于K+控制著細(xì)胞的基礎(chǔ)膜電位水平，然而，功能活躍細(xì)胞的真實(shí)膜電位水平往往偏離K+的擴(kuò)散平衡電位。另一方面，離子或分子跨膜運(yùn)輸過程的激活，則依賴于這一基本驅(qū)動(dòng)力并大多同時(shí)受細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子（H+）濃度的調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)膜質(zhì)子泵和液泡膜質(zhì)子泵控制著細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子H+濃度的電化學(xué)勢，是造成細(xì)胞膜電位偏離的重要原因[3-6]。由此可見，K+和H+濃度的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于細(xì)胞和植物的生命過程具有至關(guān)重要的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】陽離子-質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體CPAs（cation proton antiporters）廣泛存在于植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中，主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜、液泡膜和植物中的細(xì)胞器膜，可將細(xì)胞中的Na+、K+、Li+等陽離子排出，并引起細(xì)胞內(nèi)H+的內(nèi)流和積累[7-8]，維持K+和H+濃度的動(dòng)態(tài)平衡。植物中，CPAs可介導(dǎo)細(xì)胞中離子和質(zhì)子的動(dòng)態(tài)平衡，在植物的離子平衡、生長發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[7-9]。植物CPAs分為2個(gè)亞族：CPA1和CPA2，其中，CPA1包括NHX（Na+/H+exchanger），CPA2包括KEA（K+efflux antiporter，K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體）和CHX（Cation/H+exchanger）[7-9]。特別地，植物CPAs中有關(guān)KEA亞族的研究最為稀少，主要體現(xiàn)在模式作物擬南芥中。2001年，Maser等[10]最早提出擬南芥中有6個(gè)AtKEA轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，但其功能依然未知。最近研究表明，擬南芥AtKEA轉(zhuǎn)運(yùn)體定位于維管組織、保衛(wèi)細(xì)胞和花萼等不同組織部位[11]，在植物體內(nèi)K+動(dòng)態(tài)平衡和滲透調(diào)節(jié)中起主要作用[12-13]；此外，有報(bào)道表明擬南芥AtKEA1-3轉(zhuǎn)運(yùn)體在葉綠體滲透調(diào)節(jié)、光合作用及pH調(diào)控等方面起關(guān)鍵作用[12-15]。然而，果樹中有關(guān)K+/H+動(dòng)態(tài)平衡問題的研究報(bào)道鮮少，僅見于薔薇科梨基因組中KEA家族基因的鑒定及生物信息學(xué)分析[16]，具體功能依然未知。【本研究切入點(diǎn)】近30年來，關(guān)于植物K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及質(zhì)子泵的研究較為詳盡，然而，對(duì)于同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)K+和H+的K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究鮮有報(bào)道。果樹作物中，有關(guān)K+/H+動(dòng)態(tài)平衡及KEA家族基因的功能依然未知?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以‘白羅莎里奧’葡萄為材料，克隆并鑒定了4個(gè)葡萄KEA家族基因及其編碼蛋白的特征，明確該家族基因在葡萄不同組織中的表達(dá)特征及對(duì)缺鉀、ABA、NaCl和sorbitol等脅迫處理的響應(yīng)，為研究果樹K+/H+平衡與鉀素動(dòng)態(tài)營養(yǎng)機(jī)制提供了基因資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年4—12月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省高效園藝作物遺傳改良實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 試驗(yàn)材料與處理

供試材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)基地的8年生‘白羅莎里奧’葡萄（），樹體健壯，南北行向，株行距為1 m×3 m，H型平棚架式，聯(lián)棟大棚避雨設(shè)施栽培，常規(guī)田間管理。分別于特定日期采集8年生‘白羅莎里奧’的花蕾（4月30日，花序中部的花蕾）、花（5月3日，花序中部，盛開期）、新生葉片（5月24日，自頂端數(shù)起的第3片一年生新葉）、新生根（5月24日，近地表土層中側(cè)根頂端的新生細(xì)根）、幼果（5月24日，幼果迅速膨大期）和熟果（9月7日，漿果成熟期）等組織材料，隨后立即液氮冷凍并保存于-80℃冰箱中備用。脅迫試驗(yàn)供試材料為‘白羅莎里奧’試管幼苗，來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所漿果研究室。2016年8月，將生長情況一致的試管幼苗（長約12 cm）轉(zhuǎn)接于GS液體培養(yǎng)基中，于人工氣候箱（條件設(shè)置為25℃，200 μmol·m-2·s-1光照16 h；20℃，暗培養(yǎng)8 h）中預(yù)培養(yǎng)3 d，然后分別進(jìn)行缺鉀（用NaNO3和NaH2PO3分別代替GS配方中的KNO3和KH2PO4）、脫落酸（ABA，200 μmol·L-1）、氯化鈉（NaCl，160 mmol·L-1）、山梨糖醇（sorbitol，320 mmol·L-1）等處理，每個(gè)處理6株幼苗。脅迫處理48 h后，分別采集不同處理后的幼苗地上部和根部材料，立即液氮冷凍并保存于-80℃冰箱中備用。

1.3 葡萄KEA基因克隆

以擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis. org/browse/genefamily/index.jsp）的6個(gè)KEA家族基因的氨基酸序列為參考序列，在Phytozome grape genome database (http://www.phytozome.net）中檢索葡萄基因組中可能的KEA家族基因。檢索結(jié)果在Pfam（http://pfam.xfam.org/search）在線服務(wù)器預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)Phytozome獲得的葡萄的CDS序列（coding sequence），分別設(shè)計(jì)引物，利用Prime STARTM HS DNA聚合酶（TaKaRa，大連）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序驗(yàn)證后，提交NCBI GenBank獲得登錄號(hào)。

1.4 葡萄KEA家族基因的生物信息學(xué)分析

在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中獲得KEA家族各基因的CDS編碼區(qū)序列及基因組DNA序列，然后通過Gene Structure Display（http://gsds.cbi.pku.edu. cn/index.php）在線服務(wù)器進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；利用在線軟件TMpredict（http://ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html）分析葡萄KEA家族蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；使用在線服務(wù)器MEME（v4.8.1）（http://meme. nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）預(yù)測葡萄KEA家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；使用在線工具ProtParam（http:// expasy.org/tools/protparam.html）評(píng)估KEA蛋白成員的理論等電點(diǎn)、分子量、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)；利用在線軟件SignalP4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP-4.0/）預(yù)測KEA家族基因的信號(hào)肽情況；利用PSORT在線服務(wù)器（http://psort.hgc.jp/form.html）預(yù)測葡萄KEA家族基因的亞細(xì)胞定位；利用Phyre2在線服務(wù)器（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page. cgi?id=index）分析葡萄KEA家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用ClustalX 2.0軟件對(duì)葡萄KEA轉(zhuǎn)運(yùn)體與擬南芥（6個(gè)）、水稻（6個(gè)）、玉米（8個(gè)）、高粱（7個(gè)）、短柄草（5個(gè)）、楊樹（4個(gè)）、梨（12個(gè)）、蘋果（7個(gè)）等[16-17]已知物種的同源KEA轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行氨基酸比對(duì)分析，用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用NCBI的dbEST在線數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi nlm. nih.gov/dbEST/），通過Blastn比對(duì)，檢索葡萄KEA家族基因全長CDS序列和EST數(shù)據(jù)，選擇匹配率大于95%、長度大于160 bp，并且E≤10-10的結(jié)果作為對(duì)應(yīng)的EST序列，按照不同組織或器官來源進(jìn)行分類，從而獲得葡萄KEA家族基因的表達(dá)譜信息；為分析葡萄KEA家族基因的啟動(dòng)子區(qū)域，在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫檢索目的基因CDS區(qū)域起始密碼子ATG的上游1.5 kb左右的片段為啟動(dòng)子區(qū)域，并通過PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/）在線軟件分析啟動(dòng)子序列中含有的-順式作用元件。

1.5 總RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

分別采集實(shí)生幼苗和8年生葡萄樹體不同部位的組織材料，液氮冷凍后-80℃冰箱保存，通過MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）提取樣品的總RNA，并利用PrimeScriptTM RT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA作為模板，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。利用NCBI/Primer- BLAST在線服務(wù)器，設(shè)計(jì)葡萄的特異性表達(dá)引物（表1），以葡萄Ubiquitin（GenBank No. MH114011），通過ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測在葡萄樹不同組織部位的表達(dá)特征。熒光染料使用SYBR Green（TaKaRa，大連），反應(yīng)體系參照商品說明書的描述，反應(yīng)程序?yàn)?5℃30 s；95℃5 s，60℃34 s（40個(gè)循環(huán)）；72℃10 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，不同樣品在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀獲得相應(yīng)的Ct值，經(jīng)內(nèi)參基因均一化處理后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[18]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用特異性引物

1.6 數(shù)據(jù)顯著性分析

所有數(shù)據(jù)通過SPSS 13.0（SPSS Chicago，美國）軟件進(jìn)行顯著性分析，即葡萄幼苗在處理?xiàng)l件與對(duì)照條件下2個(gè)獨(dú)立樣品間進(jìn)行-檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水平0.01＜*＜0.05, **＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 葡萄KEA家族基因的克隆

以6個(gè)擬南芥KEA家族基因的氨基酸序列為參考序列，在Phytozome grape genome database（http:// www.phytozome.net）葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到4個(gè)KEA家族基因，檢索結(jié)果在Pfam在線服務(wù)器預(yù)測到K/H交換結(jié)構(gòu)域（K/H exchanger domain，PF00999）和TrkA-N domain（PF02254）功能結(jié)構(gòu)域，均屬于典型的KEA家族蛋白。檢索獲得各基因的電子序列后，以CDS序列始密碼子ATG和終止密碼子TAG所在位置22 bp左右的序列作為上下游引物，以‘白羅莎里奧’葡萄幼苗葉片RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增各個(gè)候選基因的CDS序列，分別連接到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α，篩選陽性轉(zhuǎn)化子送上海生工公司測序。經(jīng)測序驗(yàn)證后，獲得‘白羅莎里奧’葡萄的KEA家族各基因的CDS序列及相應(yīng)翻譯得到的氨基酸序列，分別命名為，提交NCBI GenBank獲得登錄號(hào)（表2）。

2.2 9種不同科屬植物KEA家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹

將葡萄（葡萄科）、擬南芥（十字花科）、水稻（禾本科）、玉米（禾本科）、高粱（禾本科）、短柄草（禾本科）、白楊（楊柳科）、梨（薔薇科）和蘋果（薔薇科）9種不同科屬的物種的KEA家族基因（表3），通過ClustalX 2.0進(jìn)行氨基酸水平的多重序列比對(duì)。結(jié)果表明，供試物種的KEA家族基因之間具有較高的同源性，同源關(guān)系較近的兩者之間的序列一致性均高于70%（數(shù)據(jù)未展示）；9種植物56個(gè)KEA家族成員在氨基酸水平依然具有28.30%的一致性，在核苷酸水平具有33.10%的一致性（數(shù)據(jù)未展示）；4個(gè)葡萄KEA家族成員在氨基酸水平具有42.20%的一致性（圖1），在核苷酸水平具有57.03%的一致性（數(shù)據(jù)未展示）。

表2 葡萄KEA家族成員基本信息

圖1 葡萄KEA氨基酸序列一致性分析

利用MEGA 7.0建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明九種植物KEA家族基因在遺傳進(jìn)化關(guān)系上有差異，葡萄和擬南芥2種雙子葉植物遺傳距離上是較近的，葡萄VvKEA1、VvKEA2和VvKEA 4分別與擬南芥AtKEA2、AtKEA3和AtKEA 5緊密聚在一起，而葡萄VvKEA3則與梨PbrKEA5和蘋果MdoKEA7緊密聚在一起（圖2）；水稻、玉米、高粱和短柄草4種禾本科植物KEA家族的相關(guān)成員，更傾向于聚在一起，而木本植物白楊、蘋果、梨KEA家族更傾向于聚在一起，特別是同屬薔薇科的蘋果和梨，遺傳距離上更為相近（圖2）。此外，9種植物KEA家族成員可分為2個(gè)亞族，GroupⅠ和Ⅱ，其中，葡萄VvKEA1和VvKEA2屬于GroupⅠ，而VvKEA3和VvKEA4屬于GroupⅡ（圖2和表2）。

2.3 葡萄KEA基因定位、編碼蛋白特征與Motif分析

葡萄KEA家族基因定位于不同染色體上（VvKEA2具體染色體未知），含有13—19個(gè)長度不一的內(nèi)含子（圖3和表2）；其中，VvKEA1基因CDS編碼區(qū)最長，其次是VvKEA3和VvKEA2，VvKEA4最短，其編碼氨基酸數(shù)目和分子量與CDS長度成正比（表2）；葡萄KEA家族蛋白的等電點(diǎn)均＜7.00，表明其含有的酸性氨基酸較多；葡萄KEA家族蛋白均含有12—13個(gè)跨膜區(qū)，均為穩(wěn)定蛋白，且只有VvKEA3具有信號(hào)肽，位于第1—26氨基酸區(qū)域（表2）。

表3 9種植物KEA家族蛋白信息

保守基序分析結(jié)果表明葡萄VvKEA3和VvKEA4蛋白均含有7個(gè)Motif基序，即Motif1—Motif7，而VvKEA1和VvKEA2均只含有4個(gè)Motif基序，即Motif3、Motif4、Motif6和Motif7，缺少M(fèi)otif1、Motif2和Motif 5（圖3和表2）；其中，Motif2、Motif3和Motif5最長，均含有50個(gè)特征氨基酸序列，而Motif6最短，含有31個(gè)氨基酸序列（圖4）。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明所有葡萄KEA家族蛋白擁有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5），暗示該家族基因可能擁有相近的功能。

2.4 葡萄KEA基因亞細(xì)胞定位預(yù)測及表達(dá)譜分析

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明葡萄KEA家族基因定位趨勢一致，均主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜，其次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（除外）和液泡膜（除外）（表4）。EST表達(dá)譜分析結(jié)果表明，葡萄KEA家族基因可能在果實(shí)中的表達(dá)水平最高，其次是葉、種子、根和雌蕊，在花、果皮、花粉和木質(zhì)部中亦有表達(dá)（圖6）。

2.5 葡萄KEA基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測

啟動(dòng)子區(qū)域-順式作用元件預(yù)測結(jié)果表明，葡萄KEA家族基因啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到至少15種的順式作用元件，包括脅迫響應(yīng)、營養(yǎng)和發(fā)育、激素響應(yīng)、晝夜規(guī)律等不同生命活動(dòng)相關(guān)的調(diào)控元件，且在不同中數(shù)量差異顯著（表5）。其中，5種（光感應(yīng)、胚乳特異表達(dá)、水楊酸響應(yīng)、熱脅迫響應(yīng)、防御和脅迫響應(yīng)）轉(zhuǎn)錄因子在全部4個(gè)的啟動(dòng)子中均能預(yù)測到，赤霉素響應(yīng)作用元件在3個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域能檢測到（除），厭氧感應(yīng)、晝夜規(guī)律、茉莉酮酸甲酯、玉米蛋白代謝、乙烯響應(yīng)和干旱響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件均能在不同的2個(gè)的啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到，此外，脫落酸響應(yīng)（）、低溫感應(yīng)（）和真菌激發(fā)子（）分別在一個(gè)的啟動(dòng)子區(qū)域出現(xiàn)（表5）。

紅色圓點(diǎn)標(biāo)注為葡萄KEA家族蛋白，紅色線條表明亞族GroupⅠ和Ⅱ的分界線

圖3 葡萄KEA家族成員Motif和基因結(jié)構(gòu)分析

圖4 不同Motif的特征序列及長度

圖5 葡萄KEA家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖6 葡萄KEA家族基因的EST表達(dá)譜分析

表4 葡萄KEA家族基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.6 葡萄KEA家族基因表達(dá)特征分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，—在8年生‘白羅莎里奧’葡萄不同組織中的表達(dá)量有差異，在不同組織中的整體表達(dá)水平最高（圖7），其他3個(gè)基因在葡萄不同組織中的表達(dá)水平較為接近，均顯著低于；在不同組織中，在花器官中的表達(dá)量最高，和在幼果中的表達(dá)量最高，在果實(shí)和葉片中的表達(dá)量較高，其中，在幼果中的表達(dá)水平最高，約為其他3個(gè)基因的4—10倍（圖7），暗示其可能在幼果發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

2.7 幼苗中葡萄KEA家族基因?qū)γ{迫處理的響應(yīng)

幼苗中，—在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)不同脅迫處理的響應(yīng)有差異：—對(duì)ABA處理最為敏感，其表達(dá)水平在檢測的地上部和根部均被顯著誘導(dǎo)；在地上部及在地上部和根部的表達(dá)水平對(duì)缺鉀處理較為敏感，其表達(dá)水平均顯著被誘導(dǎo)；在地上部和根部及在根部對(duì)sorbitol滲透處理較為敏感，其表達(dá)水平顯著被誘導(dǎo)；此外，—在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)NaCl處理沒有響應(yīng)，其表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（圖8）。

表5 葡萄KEA家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

**表示在P＜0.01水平差異極顯著。下同

A：地上部相對(duì)表達(dá)量；B：根部相對(duì)表達(dá)量。*表示在P＜0.05水平差異顯著

3 討論

果園中，適量的鉀肥施用有助于果樹發(fā)育、開花和果實(shí)品質(zhì)形成[19-22]，相關(guān)報(bào)道主要集中在生理生化層面，鉀素營養(yǎng)分子基礎(chǔ)的研究報(bào)道鮮少。植物中，KEA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類維持體內(nèi)K+動(dòng)態(tài)平衡并參與葉綠體功能、光合作用和滲透調(diào)節(jié)作用的K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，相關(guān)報(bào)道主要集中在模式作物擬南芥[8, 13-15]。果樹中有關(guān)K+/H+動(dòng)態(tài)平衡的研究依然是未知的。

近年來，植物基因組測序技術(shù)迅速發(fā)展，為植物科學(xué)研究提供了豐富的基因資源。不同物種之間，同一家族基因成員之間數(shù)目差異顯著。本研究在葡萄中克隆并鑒定了4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，與白楊（4）和草莓（5）中KEA成員數(shù)目接近，而遠(yuǎn)低于薔薇科果樹梨（12）和蘋果（7）。此外，不同物種KEA家族成員在遺傳進(jìn)化關(guān)系上存在差異，2種雙子葉植物（葡萄和擬南芥）KEA成員在遺傳距離上是較近的，4種禾本科植物（水稻、玉米、高粱和短柄草）KEA成員更傾向于聚在一起，而3種木本植物（白楊、蘋果和梨）KEA成員更傾向于聚在一起（圖2），反映了不同物種在長期進(jìn)化中依然是保守的，遺傳距離也是較近的。在4個(gè)葡萄KEA轉(zhuǎn)運(yùn)體中，VvKEA1和VvKEA2同屬于GroupⅠ，且具有6個(gè)相似的Motif，而VvKEA3和VvKEA4同屬于GroupⅡ，具有7個(gè)相似的Motif（圖2和圖3），這些結(jié)果表明，進(jìn)化關(guān)系上相近的（同一亞族）且具有類似蛋白Motif基序的兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體之間可能具有相似的功能。

前人研究表明擬南芥—主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，其中和定位于葉綠體膜上，定位于類囊體膜上[13,15]，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明葡萄—主要在細(xì)胞質(zhì)膜上（表4），與Kunz等[15]報(bào)道一致，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。Han等[11]報(bào)道指出擬南芥和主要在地上部表達(dá)，而其他4個(gè)成員基因在植物全身均有表達(dá)，與之情況一致的是，EST表達(dá)譜表明葡萄KEA家族基因在葡萄多種組織中均有表達(dá)，其中，在果實(shí)中的表達(dá)水平最高（圖6）；熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與表達(dá)譜分析是一致的，即在8年生‘白羅莎里奧’葡萄樹不同組織中，3個(gè)基因（、和）的表達(dá)量均在果實(shí)中是最高的，特別是，其表達(dá)量在所有基因、不同檢測組織中是最高的，暗示VvKEA3可能在果實(shí)發(fā)育中（特別是幼果時(shí)期）發(fā)揮重要作用的K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體。

植物KEA轉(zhuǎn)運(yùn)體在K+動(dòng)態(tài)平衡、滲透調(diào)節(jié)、光合作用及pH調(diào)控中起主要作用[12-15]。熒光定量PCR結(jié)果表明葡萄幼苗中—在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量易受缺鉀、ABA、NaCl或sorbitol等脅迫的誘導(dǎo)而上調(diào)，對(duì)不同脅迫處理的響應(yīng)有差異（圖8），其中作為葡萄KEA家族基因中整體表達(dá)量最為豐富的基因，對(duì)脅迫處理最為敏感，其表達(dá)水平極易受缺鉀、ABA和sorbitol處理的影響而顯著增強(qiáng)，與擬南芥[13]和大豆[23]中報(bào)道的現(xiàn)象類似；此外，Chen等[23]報(bào)道表明大豆KEA基因易受NaCl處理誘導(dǎo)表達(dá)，然而，本研究中—對(duì)NaCl處理沒有響應(yīng)，說明禾本科植物與木本科植物同源家族基因的功能或調(diào)控機(jī)制方面可能存在差異；盡管與對(duì)NaCl處理沒有響應(yīng)，但對(duì)等滲作用的sorbitol處理較為敏感，直接表明葡萄與易受滲透作用的脅迫誘導(dǎo)，而不受鹽離子作用（Na+），這些發(fā)現(xiàn)與擬南芥中和的報(bào)道是一致的[13]。

此外，-順式作用元件可通過與啟動(dòng)子區(qū)域的關(guān)鍵元件結(jié)合來控制啟動(dòng)子效率，進(jìn)而調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)[24-26]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄KEA家族基因啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到多種順式作用元件（表5），特別地，啟動(dòng)子區(qū)域含有脫落酸（ABA）響應(yīng)的作用元件，而該基因的表達(dá)水平在葡萄幼苗全身組織中是受ABA處理誘導(dǎo)的；—啟動(dòng)子區(qū)域均含有光感應(yīng)、胚乳特異表達(dá)、水楊酸響應(yīng)、熱脅迫響應(yīng)及防御與脅迫相關(guān)的作用元件，這些發(fā)現(xiàn)與同為鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的KT/HAK/KU家族轉(zhuǎn)運(yùn)體的報(bào)道是類似的[23-25]，也為進(jìn)一步研究葡萄KEA轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能及其調(diào)控機(jī)理提供了理論支持。

本文為研究果樹K+/H+平衡及鉀素動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)，并為高效園藝作物的遺傳改良與育種奠定了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從葡萄中克隆并鑒定了4個(gè)KEA家族基因，該家族基因主要在葡萄果實(shí)、葉片和種子中表達(dá)；葡萄KEA成員與擬南芥KEA成員同源性較高；在成年葡萄樹中的整體表達(dá)水平最為豐富（幼果中最高）。幼苗中在轉(zhuǎn)錄水平受缺鉀、ABA和sorbitol滲透脅迫的調(diào)控；VvKEA3是葡萄果實(shí)中重要的K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體。

[1] VéRY A A, SENTENAC H. Molecular mechanisms and regulation of K+transport in higher plants., 2003, 54: 575-603.

[2] GRABOV A. Plant KT/KUP/HAK potassium transporters: Single family - multiple functions., 2007, 99: 1035-1041.

[3] PALMGREN M G. Plant plasma membrane H+-ATPases: Powerhouses for nutrient uptake., 2001, 52: 817-845.

[4] FELLE H H. pH: Signal and messenger in plant cells., 2001, 3: 577-591.

[5] SZE H, SCHUMACHER K, Muller M L, PADMANABAN S, TAIZ L. A simple nomenclature for a complex proton pump: VHA genes encode the vacuolar H+-ATPase., 2002, 7:157-161.

[6] FELLE H H. pH regulation in anoxic plants., 2005, 96: 519-532.

[7] CHANROJ S, LU Y, PADMANABAN S, NANATANI K, UOZUMI N, RAO R, SZE H. Plant-specific cation/H+exchanger 17 and its homologs are endomembrane K+transporters with roles in protein sorting., 2011, 286(39): 33931-33941.

[8] CHANROJ S, WANG G, VENEMA K, ZHANG M W, DELWICHE C F, SZE H. Conserved and diversified gene families of monovalent cation/H+antiporters from algae to flowering plants., 2012, 3: 25.

[9] BASSIL E, BLUMWALD E. The ins and outs of intracellular ion homeostasis: NHX-type cation/H+transporters., 2014, 22: 1-6.

[10] MASER P, THOMINE S, SCHROEDER J I, WARD J M, HIRSCHI K, SZE H, TALKE IN, AMTMANN A, MAATHUIS F J, SANDERS D, HARPER J F, TCHIEU J, GRIBSKOV M, PERSANS M W, SALT DE, KIM S A, GUERINOT M L. Phylogenetic relationships within cation transporter families of., 2001, 126: 1646-1667.

[11] HAN L, LI J L, WANG L, SHI W M, SU Y H. Identification and localized expression of putative K+/H+antiporter genes in., 2015, 37(5): 1-14.

[12] ARANDA-SICILIA M N, CAGNAC O, CHANROJ S, SZE H, RODRíGUEZ-ROSALES M P, VENEMA K.KEA2, a homolog of bacterial KefC, encodes a K+/H+antiporter with a chloroplast transit peptide., 2012, 1818(9): 2362-2371.

[13] ZHENG S, PAN T, FAN L G, QIU Q S. A novelgene family, homolog of bacterial K+/H+antiporters, plays potential roles in K+homeostasis and osmotic adjustment in., 2013, 8(11): e81463.

[14] ARMBRUSTER U, CARRILLO L R, VENEMA K, PAVLOVIC L, SCHMIDTMANN E, KORNFELD A, JAHNS P, BERRY J A, KRAMER D M, JONIKAS M C. Ion antiport accelerates photosynthetic acclimation in fluctuating light environments., 2014, 5: 5439.

[15] KUNZ H H, GIERTH M, HERDEAN A, SATOH-CRUZ M, KRAMER D M, SPETEA C, SCHROEDER J I. Plastidial transporters KEA1, -2, and -3 are essential for chloroplast osmoregulation, integrity, and pH regulation in., 2014, 111(20): 7480-7485.

[16] ZHOU H, QI K, LIU X, YIN H, WANG P, CHEN J, WU J, ZHANG S. Genome?wide identification and comparative analysis of the cation proton antiporters family in pear and four otherspecies., 2016, 291: 1727-1742.

[17] 韓蕾, 宋志忠, 王莉, 蘇彥華. 7種植物K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的生物信息學(xué)分析. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2011, 30(3): 372-378.

HAN L, SONG Z Z, WANG L, SU Y H. Bioinformatics analysis of 7 plants’ K+/H+antiporters., 2011, 30(3): 372-378. (in Chinese)

[18] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod., 2001, 25(4): 402-408.

[19] DEMIRAL M A, K?SEOGLU A T. Effect of potassium on yield, fruit quality, and chemical composition of green house-grown aalia melon., 2005, 28: 93-100.

[20] YURTSEVEN E, KESMEZ G D, üNLüKARA A. The effects of water salinity and potassium levels on yield, fruit quality and water consumption of a native central anatolian tomato species ()., 2005, 78: 128-135.

[21] HARTZ T K, JOHNSTONE P R, FRANCIS D M, MIYAO E M. Processing tomato yield and fruit quality improved with potassium fertigation., 2005, 40: 1862-1867.

[22] 宋志忠, 郭紹雷, 馬瑞娟, 俞明亮. KT/HAK/KUP家族基因在桃開花期的表達(dá)及對(duì)鉀肥施放的響應(yīng)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(6): 1177-1185.

SONG Z Z, GUO S L, MA R J, YU M L. Analysis of expression of KT/HAK/KUP family genes and their responses to potassium fertilizer application during peach flowering., 2015, 48(6): 1177-1185. (in Chinese)

[23] CHEN H T, CHEN X, WU B Y, YUAN X X, ZHANG H M, CUI X Y. Whole-genome identification and expression analysis of K+efflux antiporter (KEA) and Na+/H+antiporter (NHX) families under abiotic stress in soybean., 2015, 14(6): 1171-1183.

[24] GUPTA M, QIU X, WANG L, XIE W, ZHANG C J, XIONG L Z, LIAN X M, ZHANG Q F. KT/HAK/KUP potassium transporters gene family and their whole-life cycle expression profile in rice ()., 2008, 280: 437-452.

[25] SONG Z Z, MA R J, YU M L. Genome-wide analysis and identification of KT/HAK/KUP potassium transporter gene family in peach ()., 2015, 14(1): 774-787.

[26] ZHANG Z, ZHANG J, CHEN Y, LI R, WANG H, WEI J. Genome- wide analysis and identification of HAK potassium transporter gene family in maize (L.)., 2012, 39: 8465-8473.

Cloning, Characterization and Expression Analysis of K+/H+Antiporter Genes in Grape

WANG ZhuangWei1, WANG QingLian1, XIA Jin1, WANG XiCheng1, SONG ZhiZhong1,2, WU WeiMin1

（1Institute of Pomology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory of Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014;2School of Agriculture, Ludong University, Yantai 264025, Shandong)

【Objective】Isolation and characterization of KEA family genes from grape. Analysis of the tissue-specific expression patterns of KEA family genes and response to K+depletion, ABA, NaCl and sorbitol treatments. Screen the potential major KEA genes in grape. 【Method】By carring out homology-based cloning, putative KEA family genes were isolated and characterized from grape.A phylogenetic tree was constructed by multiple alignment of KEA family proteins from 9 known plants (grape,, rice, maize, sorghum, slender false brome, polar, pear, and apple) using the neighbor-joining method via MEGA7.0 software. Details of grape KEA family genes and encoded proteins were analyzed with the help of bioinformatical analysis softwares. By screening the EST database, electrical expression profiles of grape KEA genes were determined. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was carried out to analyze the expression patterns of KEA family genes and response to K+depletion, ABA, NaCl, and sorbitol treatments, and obtained the major genes. 【Result】Four KEA family genes were isolated from grape, entitled by—, which were all containing the K/H exchanger and TrkA-N functional domains that belonging to the classic plant KEA family antiporters. The amino acid sequences of KEA proteins from 9 plants shared an overall identity of 33.10%. These KEA members were classified into 2 major groups (Groups Ⅰ and Ⅱ), and VvKEA1and VvKEA2 belong to Group Ⅰ that containing 7 Motifs, while VvKEA3 and VvKEA4 belong to GroupⅡ that just containing 4 Motifs. Phylogenetic tree analysis showed that VvKEA1, VvKEA 2 and VvKEA 4 of grape were closely clustered with AtKEA2, AtKEA 3 andAtKEA 5 of, respectively, and VvKEA3 was clustered with PbrKEA5 of pear and MdoKEA7 of apple. KEA members of 4 grass family plants (rice, maize, sorghum and slender false brome) were prone to clustered together, while three woody plants (polar, apple and pear) KEA members were prone to clustered together. Mainly localized in plasma membrane, all predicted VvKEA proteins possessed similar tertiary structures, contained 12 or 13 transmembrane domains (TMs), and the theoretical isoelectric point () were all less than 7.0. In particular, only VvKEA3 possessed the signalpeptide. Fifteen-acting regulatory elements, including the stress response, nutrition and development, hormone response and circadian rhythm regulations, et al., were identified in the promoter region ofgenes. Expression profile analysis showed thatfamily genes were expressed in different tissues or organs in grape, and the highest percentage was predicted in fruit, followed by leaf, seed, root and pistil. qRT-PCR analysis showed thatwas the most abundant expressed gene during different parts of 8-year-old ‘’ on the whole, especially in fruitlet, and the other 3 genes were less expressed with similar amount.In grape seedlings,—genes were more sensitive to ABA treatment, whose expression were all induced in both tested shoots and roots, but had no response to NaCl treatment. The expression ofVvKEA3 in both shoots and roots and VvKEA1 in shoots were up-regulated by K depletion treatment, and the expression of VvKEA3 in both shoots and roots and VvKEA4 in roots were increased by sorbitol treatment. 【Conclusion】Four predicted KEA family genes were cloned and characterized from grape, which were majorly expressed in fruit, leaf and seed. Notably,was the most abundant gene in 8-year old grape tree, especially in fruitlet, whose expression was prone to be regulated by K+depletion, ABA, and sorbitol osmotic stress. VvKEA3 may be a crucial

grape; K+/H+antiporter; bioinformaticsanalysis; stress treatment

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.011

2018-05-14；

2018-06-21

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目（CX(17)3031）、國家自然科學(xué)基金（31501743）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-29-11）、江蘇省政府留學(xué)獎(jiǎng)學(xué)金（JS-2016-190）

王壯偉，Tel：025-83491977；E-mail：wzhuangzhuang@hotmail.com。

宋志忠，Tel：025-84390255；E-mail：szhzh2000@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）