酶解黃秋葵籽蛋白制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化

郭溆，田碩，程安瑋，王新坤，王青，劉超，孫金月，*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100；2.濟(jì)南市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，山東濟(jì)南250000）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）為錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（Abelmoschus Medic）一年生草本植物。黃秋葵種子近球形，種皮呈灰黑色至褐色，有小腺體，揉之有咖啡香味，干粒約重55 g～75 g。目前黃秋葵種子主要用于油脂的提取，隨之會產(chǎn)生大量的餅粕。黃秋葵種子蛋白質(zhì)含量豐富約占20%，脫脂后可達(dá)55%[1]，蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值與大豆蛋白接近[2]。隨著人們生活水平的不斷提高，對植物蛋白的需求量也越來越大，植物蛋白不僅可作為食品添加劑，也可作為營養(yǎng)成分補(bǔ)充人體所需的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)由于其分子量大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，攝入人體后不易被消化吸收，從而影響了其生理功能和營養(yǎng)價(jià)值的有效發(fā)揮。

近年來，多肽在生物體內(nèi)所發(fā)揮的生理功能受到越來越多的重視。多肽與蛋白質(zhì)相比，具有結(jié)構(gòu)簡單分子量小的特點(diǎn)，多肽不僅能為機(jī)體提供營養(yǎng)，還具有調(diào)節(jié)植物神經(jīng)系統(tǒng)、活化細(xì)胞免疫機(jī)能、改善心血管功能、抗衰老等多種生理活性功能[3]。氧化與人類的癌癥、老化、動脈硬化等多種疾病相關(guān)，適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以降低體內(nèi)自由基水平，防止脂質(zhì)過氧化，幫助機(jī)體抵御疾病，對于預(yù)防和治療心血管、糖尿病、癌癥、衰老等慢性病有一定的療效。1960年Marcuse首次報(bào)道了多肽具有抗氧化活性[4]，此后對食源性抗氧化肽的活性研究引起廣泛關(guān)注，并發(fā)現(xiàn)許多來自食物蛋白的寡肽或多肽具有抗氧化活性[5-8]。因此，通過蛋白質(zhì)的可控酶解技術(shù)制備天然的抗氧化肽，研究開發(fā)多肽類抗氧化食品、保健品具有十分重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。

目前利用制備的黃秋葵籽粕蛋白開發(fā)活性肽的研究還鮮見報(bào)道，個(gè)別有關(guān)黃秋葵籽蛋白酶解工藝的優(yōu)化多以提高水解度為目標(biāo)[9]。由于水解度與抗氧化能力之間并不是單純的線性關(guān)系[10]，根據(jù)蛋白水解度制備的抗氧化肽的活性還不是很高。該研究將利用制備的黃秋葵籽粕蛋白為原料，探究應(yīng)用響應(yīng)面法（response surface method，RSM）優(yōu)化制備抗氧化活性肽的最佳酶解條件，獲得利用黃秋葵籽粕蛋白制備具有較強(qiáng)抗氧化活性多肽的最佳工藝，為黃秋葵籽粕的精深加工開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵籽收獲于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所章丘龍山試驗(yàn)基地。將黃秋葵籽干燥后粉碎，使用石油醚作為溶劑，采用索氏提取裝置去除黃秋葵籽中的油脂，獲得的籽粕低溫烘干后備用。

復(fù)合蛋白酶（1.5AU-A/g）、堿性蛋白酶（2.4AU-A/g）、中性蛋白酶（0.8AU-A/g）、風(fēng)味蛋白酶（500LAPU/g）：諾維信公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀，石油醚：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AR423CN型電子天平：美國奧豪斯公司；Allegra 25R型高速冷凍離心機(jī)：美國Beckman公司；LXJ-IIB離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏公司；FE20K型臺式酸度計(jì)：美國梅特勒-托利多公司；907型超低溫冰箱：美國賽默飛世爾公司；Lab-1A-50E型真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康公司；UV-1800型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 黃秋葵籽粕蛋白的制備

稱取黃秋葵籽粕置于燒杯中，按1∶10（g/mL）的料液比加入去離子水，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值到11.0，180 W超聲2.5 h提取蛋白，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至3.80，離心收集沉淀，沉淀置于-60℃真空冷凍干燥機(jī)中凍干，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 最適蛋白酶的篩選

稱取5等份黃秋葵籽粕蛋白溶于去離子水中，分別加入不同的蛋白酶（加酶量6.25%，底物濃度2%），在各自最適溫度和pH值條件下（詳見表1），酶解8 h。然后將反應(yīng)液置于沸水中10 min滅酶活，離心取上清液，分別測定水解度和DPPH自由基清除率，篩選出最適合黃秋葵籽粕蛋白酶解的蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Optimal reaction conditions of five proteases

1.2.3 多肽制備的單因素試驗(yàn)

選用篩選出的最適蛋白酶，設(shè)定底物濃度、加酶量（[E]/[S]）、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH值5個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn)。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，除被考察單因素外，其它4個(gè)因素均設(shè)定為相同的固定值。采用水解度和DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，研究各種單因素對制備多肽的抗氧化活性的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取加酶量（A）、酶解時(shí)間（B）、底物濃度（C）、酶解溫度（D）作為自變量進(jìn)行組合，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，確定最佳制備工藝，并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.5 黃秋葵籽粕蛋白酶解效果指標(biāo)的測定

1.2.5.1 酶解物水解度的測定

待測樣品酶解過程中，通過不斷滴加0.5 mol/L NaOH溶液使混合液pH值保持不變，并記錄一定時(shí)間間隔的堿液消耗量，用于計(jì)算黃秋葵籽粕蛋白的水解度。水解度（degrees of hydrolysis，DH）的計(jì)算采用pH-state法[11]，該方法的原理是根據(jù)水解過程中釋放質(zhì)子的量對水解度進(jìn)行測定。其計(jì)算公式為：

式中：C為NaOH溶液濃度，mol/L；V為NaOH溶液消耗體積，mL；m為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；h為每克黃秋葵籽粕蛋白原料中肽鍵的毫摩爾數(shù)（h=7.84 mmol/g）；T為試驗(yàn)溫度，K；α為氨基的平均離解度；pKa為α-氨基的解離度的負(fù)對數(shù)。

1.2.5.2 酶解物對DPPH自由基清除率的測定

分別配制133.3 mg/L的待測樣品溶液和0.1mmol/L的DPPH溶液。取1 mL待測樣品液加入1 mL DPPH溶液，混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長下測定吸光度值A(chǔ)i。向1 mL去離子水中加入1 mL待測樣品溶劑，作為空白組記錄吸光度為Aj。向1 mL去離子水中加入1 mL DPPH溶劑，作為對照組記錄吸光度為A0[12-14]。使用無水乙醇調(diào)零，計(jì)算公式為：

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS Statistics 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05表示差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01說明差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解蛋白酶的篩選

通過水解度和DPPH自由基清除力兩個(gè)指標(biāo)對水解蛋白酶進(jìn)行篩選，結(jié)果表明5種蛋白酶水解得到的酶解產(chǎn)物的水解度和DPPH自由基清除力均不同，見圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解對黃秋褲籽粕多肽水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of proteases on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate of peptides prepared from okra seed meal protein

由圖1A可以看出，5種酶的水解反應(yīng)都符合酶反應(yīng)動力學(xué)曲線變化規(guī)律，在酶反應(yīng)的最初1 h內(nèi)水解度隨著時(shí)間的延長而逐漸增加，1 h后水解反應(yīng)逐漸趨于平穩(wěn)，5種酶的水解速度從高到低依次是：堿性蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶；由圖1B可以看出，堿性蛋白酶酶解后得到的多肽對DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)。因此，綜合考慮水解度和水解產(chǎn)物的抗氧化能力，后續(xù)研究將選用堿性蛋白酶對黃秋葵籽粕蛋白進(jìn)行酶解。

2.2 單因素試驗(yàn)分析

2.2.1 底物濃度對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定加酶量6%、酶解時(shí)間8 h、酶解溫度50℃，在pH 8.0的條件下，測定不同底物濃度對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖2。

圖2 底物濃度對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of substance concentrations on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結(jié)果表明，隨著底物濃度的增加，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在底物濃度數(shù)為0.75%時(shí)達(dá)到最大值49.3%，隨后開始降低。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果變化趨勢，選擇0.5%、0.75%、1.0%3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.2 加酶量對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定底物濃度3%、酶解時(shí)間8 h、酶解溫度50℃，在pH值為8.0的條件下，研究不同加酶量對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖3。

圖3 加酶量對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of enzyme dosage on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結(jié)果表明，DPPH自由基清除率隨著加酶量的增加呈先升后降的趨勢，在2%時(shí)DPPH自由基清除率最低，僅為24.71%，在6%時(shí)清除率最高，達(dá)到47.39%，隨后隨著加酶量的不斷增加清除率呈逐漸降低的趨勢。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果變化趨勢，選擇4%、6%、8%3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.3 酶解時(shí)間對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定底物濃度3%、加酶量6%、酶解溫度50℃，在pH值為8.0的條件下，研究不同酶解時(shí)間對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of hydrolysis time on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結(jié)果表明，2.5 h～4 h之間隨著時(shí)間的增加DPPH自由基清除率呈現(xiàn)緩慢增加趨勢，在4 h時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到最高（48.35%），隨后隨著時(shí)間的增加DPPH自由基清除率逐漸降低。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果變化趨勢，選擇3.5、4、4.5 h 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.4 酶解溫度對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定底物濃度3%、加酶量6%、酶解時(shí)間8 h，在pH值為8.0的條件下，研究不同酶解溫度對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖5。

圖5 酶解溫度對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of temperature on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結(jié)果表明，DPPH自由基清除率在5℃時(shí)達(dá)到最大（47.59%），之后隨著時(shí)間的增加，逐漸降低。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果變化趨勢，選擇45、50、55℃3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.5 pH值對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定底物濃度3%、加酶量6%、酶解時(shí)間8 h、酶解溫度50℃的條件下，研究不同pH值對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖6。

圖6 pH值對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of pH value on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結(jié)果表明，隨著pH值的升高，DPPH自由基清除率呈先升高后降低的趨勢，在pH值為8時(shí)達(dá)到最大值，結(jié)果與堿性蛋白酶的最適pH值相吻合。因此，后續(xù)試驗(yàn)制備活性肽時(shí)選用的最適酶解pH值為8.0，而不選擇pH值作為響應(yīng)面分析的因素。

2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化黃秋葵籽粕抗氧化肽制備工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了相應(yīng)的三水平（見表2）并進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定黃秋葵籽粕抗氧化肽的最優(yōu)制備方法，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的自變量因素及水平設(shè)計(jì)Table 2 Independent variables and their levels used in response surface design

表3 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

續(xù)表3 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 Response surface experimental design and results

通過Design-Expert 8.0軟件對各因素進(jìn)行回歸擬合，根據(jù)表2得到以下多元二次回歸方程：

DPPH自由基清除率Y/%=+50.88-1.38A-0.30B-2.22C+0.84D-0.86AB+0.50AC+0.52AD+1.31BC+1.64BD+1.70CD-3.67A2-1.74B2-2.89C2-8.66D2。

對黃秋葵籽粕抗氧化肽的制備工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果表明（表3）該模型差異顯著（P值＜0.000 1），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)不顯著（P值=0.293 5＞0.05），說明試驗(yàn)誤差小。模型的決定系數(shù)R2=0.953 6，響應(yīng)值（DPPH自由基清除率）與變量（底物濃度、加酶量、酶解時(shí)間和酶解溫度）之間具有很好的線性關(guān)系，校正決定系數(shù)R2（adj）=0.907 2＞0.80，說明總黃酮提取率的變化有90.72%來自于所選的變量。

方差分析結(jié)果表明（表4），模型的自變量二次項(xiàng)BD、CD、B2均達(dá)顯著水平（P＜0.05）；一次項(xiàng) A、C，二次項(xiàng) A2、C2、D2均呈極顯著水平（P＜0.01）。根據(jù) F 值的大小順序推斷變量對響應(yīng)值的影響程度依次為：底物濃度（C）＞加酶量（A）＞酶解溫度（D）＞酶解時(shí)間（B）。

表4 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

續(xù)表4 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Continue table 4 Analysis of variance for quadric regression model

2.3.2 因素間的交互影響

通過回歸方程得到三維響應(yīng)曲面圖及相應(yīng)的二維等高線圖，根據(jù)其可直觀地看出4個(gè)變量對響應(yīng)值的影響，并確定最佳工藝條件的范圍，見圖7。

圖7 任意兩變量交互作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface plots for the synergetic effects of any two variables on DPPH radical scavenging activity

結(jié)果表明，加酶量和底物濃度對酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡；其次是酶解溫度；酶解時(shí)間對總酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響最小，表現(xiàn)為曲面較為平緩。加酶量和酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解溫度以及底物濃度和酶解溫度的相互作用較為顯著，表現(xiàn)為等高線呈現(xiàn)橢圓形；其它因素的相互作用不顯著，表現(xiàn)為等高線呈圓形。

2.3.3 最佳酶解條件的預(yù)測及試驗(yàn)驗(yàn)證

通過對二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型進(jìn)行解析，得出酶解蛋白的最佳工藝條件為：加酶量5.8%、酶解時(shí)間3.81 h、底物濃度0.68%、酶解溫度49.88℃、pH 8.0。該條件下，黃秋葵籽蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率的預(yù)測值為51.54%。為檢驗(yàn)該方法的可靠性，根據(jù)實(shí)際的操作條件，將黃秋葵籽蛋白酶解的最佳條件修正為：加酶量6%、酶解時(shí)間3.8 h、底物濃度0.7%、酶解溫度50℃、pH 8.0。修正條件下，實(shí)際測得黃秋葵籽蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率為50.83%，與預(yù)測值相比偏差為1.38%，證實(shí)了模型的有效性。

3 結(jié)論

選用5種蛋白酶對黃秋葵籽粕蛋白進(jìn)行酶解，以蛋白水解度和DPPH自由基清除率為指標(biāo)，篩選確定堿性蛋白酶為水解黃秋葵籽粕蛋白的最佳蛋白酶。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面法對黃秋葵籽粕蛋白制備抗氧化肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，具有良好的顯著性。試驗(yàn)結(jié)果表明，加酶量和底物濃度對酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響最為顯著。利用黃秋葵籽粕蛋白制備抗氧化肽的最佳條件為：加酶量6%、酶解時(shí)間3.8 h、底物濃度0.7%、酶解溫度50℃、pH 8.0，該條件下通過試驗(yàn)獲得的DPPH自由基清除率為50.83%，與模型預(yù)測值相近，充分驗(yàn)證了該模型的可靠性。該研究利用黃秋葵籽粕蛋白作為原料開展制備抗氧化肽的研究，旨在提高黃秋葵種子及其籽粕的利用率，為黃秋葵種子及其籽粕的精深加工與開發(fā)利用奠定了理論技術(shù)基礎(chǔ)，并且具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。