白藜蘆醇抗疲勞作用及其機理研究

（河南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院，河南鄭州450001）

疲勞是涉及許多生理和生化作用的一種機體復(fù)雜綜合癥狀，也是腦力或體力活動達到一定強度時必須發(fā)生的機體生理保護現(xiàn)象[1]。疲勞不僅使機體工作能力暫時下降，而且還是機體處于亞健康狀態(tài)或發(fā)展成疾病狀態(tài)的前兆，表明機體的健康即將或已經(jīng)受到損害。根據(jù)癥狀表現(xiàn)不同，疲勞可分為體力和腦力疲勞。體力疲勞（也稱外周疲勞）主要表現(xiàn)為運動能力下降，機體不能維持預(yù)定的運動強度。腦力疲勞主要表現(xiàn)為意志和行為的負面變化，如精神失常、健忘、失眠、抑郁、頭暈等。體力疲勞是影響機體健康的重要因素之一，長期持續(xù)體力疲勞可能會導(dǎo)致機體過早衰老、患腫瘤、心腦血管等疾病風(fēng)險增高[2]。在過去的幾十年里，研究人員對體力疲勞的機理進行了眾多研究，并提出了各種理論，如阻塞理論、能源物質(zhì)耗竭理論、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)理論、保護抑制理論、突變理論、自由基理論等[3]，其中，自由基理論最受關(guān)注。自由基能引起線粒體呼吸鏈產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）過程受損，使細胞能量合成發(fā)生障礙，影響肌纖維收縮功能；另外，運動時機體代謝增強，耗氧量增加，導(dǎo)致機體各組織中產(chǎn)生過多的自由基與活性氧（reactive oxy gen species，ROS），這可能超過機體自身抗氧化防御系統(tǒng)（酶與非酶）的清除能力，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過量的自由基與ROS可以攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等細胞大分子，從而使正常的細胞功能惡化，出現(xiàn)組織損傷、肌肉收縮能力下降等現(xiàn)象而產(chǎn)生疲勞[4]。近年來的研究已證實，外源性抗氧化劑可通過抑制或阻止細胞內(nèi)可氧化底物的氧化、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、直接清除自由基或與內(nèi)源性抗氧化劑形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來降低氧化應(yīng)激，延遲體力疲勞[5]。因此，對機體補充外源性抗氧化劑是延緩體力疲勞的一種行之有效的方法。近些年，一些多糖、皂苷、黃酮類化合物、小分子肽類等天然抗氧化活性成分已被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗疲勞作用[3，6-7]。

白藜蘆醇（3，4'，5-三羥基芪，resveratrol）為二苯乙烯類的多酚類化合物，是植物面對病原體感染和各種自然惡劣條件下而產(chǎn)生的一種天然植物化學(xué)物質(zhì)。目前白藜蘆醇已在葡萄、花生、部分漿果及草藥等70多種植物中被發(fā)現(xiàn)，其中葡萄皮中含量最高，可達50 mg/kg～100 mg/kg[8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗衰老、抗病毒、保護肝與腎及免疫調(diào)節(jié)作用[9]。此外，白藜蘆醇在體內(nèi)、體外均表現(xiàn)出強烈的抗氧化活性，能有效的清除各類自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[10-11]。鑒于白藜蘆醇的強抗氧化性，可以推測白藜蘆醇有可能與機體內(nèi)源性抗氧化酶協(xié)同作用，清除劇烈運動產(chǎn)生的過量自由基、降低氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗疲勞作用。因此，本研究采用力竭訓(xùn)練動物模型，在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，分別灌胃不同劑量白藜蘆醇，測定其抗疲勞效果，并從不同角度入手，探尋其抗疲勞可能的機制，這將為白藜蘆醇在運動營養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用及開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化學(xué)品與試劑

白藜蘆醇（純度99%）：北京萊耀生物科技有限公司；血乳酸（blood lactic acid，BLA）測定試劑盒：北京雷根生物技術(shù)有限公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測定試劑盒：中生北控生物科技有限公司；肝、肌糖原測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒：南京建城生物技術(shù)研究所；試驗中所使用的其他化學(xué)品均為分析純，試劑的配制采用雙蒸水。

1.1.2 主要儀器

ZH-PT型動物實驗跑臺：安徽正華生物儀器設(shè)備公司；UV5型分光光度計：瑞士梅特勒-托利多公司；HH-501型水浴鍋：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；5424R臺式離心機：德國Eppendorf公司；ELx808型酶標儀：美國Biotek公司；QL-901型旋渦混合器：海門市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.1.3 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（體重180 g～200 g）：河南省實驗動物中心提供。動物分籠飼養(yǎng)于標準化飼養(yǎng)室，保持12 h的晝夜循環(huán)，室內(nèi)溫度控制在（22±2）℃，濕度控制在（50±5）%；動物自由攝取標準飼料與水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與治療

經(jīng)過7 d適應(yīng)環(huán)境后，將大鼠按體重隨機分為4組，每組8只，分別是低劑量白藜蘆醇組（low-dose resveratrol treatment group，L-ReG）、中劑量白藜蘆醇組（medium-dose resveratrol treatment group，M-ReG）、高劑量白藜蘆醇組（high dose resveratrol treatment group，H-ReG）、空白對照組（control group，CG）。3個白藜蘆醇組分別接受25、50、100 mg/kg·bw劑量的白藜蘆醇灌胃治療（劑量選擇來自于預(yù)實驗，白藜蘆醇溶于1.0 mL蒸餾水中制成懸浮液），空白對照組接受等劑量蒸餾水，每天一次，連續(xù)4周。所有的動物實驗操作均嚴格依照《國務(wù)院實驗動物管理條例》以及《河南省實驗動物管理辦法》中的相關(guān)規(guī)定進行，并被河南工業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.2.2 大鼠跑步運動

大鼠跑步運動包括適應(yīng)性訓(xùn)練、強化訓(xùn)練及力竭實驗。第1周進行適應(yīng)性訓(xùn)練，藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實驗跑臺上（跑道規(guī)格為1 000 mm×90 mm×120 mm）進行跑步20 min訓(xùn)練（坡度傾角設(shè)置為0°，速度15 m/min）；第2～4周進行強化訓(xùn)練，藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實驗跑臺上進行跑步20 min訓(xùn)練（坡度傾角設(shè)置為0°，速度30 m/min）；第4周最后一天（第28天），藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實驗跑臺上進行力竭跑步實驗，坡度傾角設(shè)置為10°，以速度30 m/min跑步至力竭。力竭被定義為大鼠不能繼續(xù)跑動，呼吸急促、俯臥垂頭、滯留跑道后端，經(jīng)電刺激后仍無效，且抓起大鼠時無掙扎動作[12]。記錄力竭跑步時間。

1.2.3 疲勞相關(guān)生化指標測定

力竭跑步結(jié)束后，將大鼠在乙醚麻醉后剖開腹腔，腹主動脈取血，儲存在-80℃用于分析BLA與BUN；然后快速切除肝臟與股四頭肌，用預(yù)冷生理鹽水漂洗后濾紙吸干，然后儲存在-80℃用于測定肝、肌糖原含量以及肝組織中SOD、GPx、CAT、MDA的含量。所有生化指標測定均按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

測定結(jié)果用mean±SD表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件進行過單因素方差（ANOVA）分析，組間比較用Post Hoc檢驗，p＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對大鼠力竭跑步時間的影響

在運動過程中，耐力增強代表著疲勞感降低，因此判定藥物抗疲勞作用最直接指標是運動耐力的強弱[13]。動物力竭跑步運動一種實驗性運動模型，很適合評價機體運動耐力，并具有良好的重現(xiàn)性，力竭時間的長短能夠客觀反映藥物抗疲勞能力[14]。白藜蘆醇對大鼠力竭跑步時間的影響見圖1。

由圖1可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）力竭跑步時間均顯著增加（p＜0.05），增加率分別為13.59%、25.60%、34.73%。這表明，白藜蘆醇能延長大鼠力竭跑步時間，增強運動耐力，具有抗疲勞作用。

圖1 白藜蘆醇對大鼠力竭跑步時間的影響Fig.1 Effects of resveratrol on the exhausted running time of rats

2.2 白藜蘆醇對運動后大鼠血乳酸的影響

糖酵解是劇烈運動的主要能量來源。當(dāng)肌肉從無氧酵解中獲得足夠能量時，會產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量乳酸（碳水化合物的糖酵解產(chǎn)物）；乳酸濃度的增加會降低肌肉和血液中pH值，從而引起各種生理和生化副作用而產(chǎn)生疲勞。減少乳酸的堆積或快速清除乳酸有利于緩解體力疲勞[15]。因此，BLA是體力疲勞的敏感指標之一。白藜蘆醇對運動后大鼠血乳酸的影響見圖2。

圖2 白藜蘆醇對運動后大鼠血乳酸的影響Fig.2 Effects of resveratrol on the blood lactic acid of rats

由圖2可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）BLA含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為 15.82%、19.42%、34.58%。這說明，白藜蘆醇能減少運動后乳酸的堆積或快速清除乳酸，從而緩解疲勞。

2.3 白藜蘆醇對運動后大鼠血尿素氮的影響

尿素氮是蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物。尿素在肝臟中形成，是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，由血液攜帶到腎臟排泄[16]。當(dāng)碳水化合物和脂肪分解代謝所產(chǎn)能量無法滿足機體需要時，蛋白質(zhì)和氨基酸就開始分解代謝以滿足能量需求。BUN含量增加會反映出蛋白質(zhì)和氨基酸的分解加劇，這會破壞肌肉收縮力并最終導(dǎo)致體力疲勞。BUN和運動耐力之間存在負相關(guān)，即機體能夠適應(yīng)運動耐力程度越低，BUN增加就越顯著[17]。因此，BUN是體力疲勞的另一敏感指標。白藜蘆醇對運動后大鼠血尿素氮的影響見圖3。

圖3 白藜蘆醇對運動后大鼠血尿素氮的影響Fig.3 Effects of resveratrol on the blood urea nitrogen of rats

由圖3可以看出，與空白對照組（CG）組相比，中、高劑量白藜蘆醇組（M-ReG、H-ReG）BUN含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為 14.98%、24.14%；低劑量白藜蘆醇組（L-ReG）BUN含量雖然也輕微降低，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。這說明，白藜蘆醇能減少BUN的積累，降低蛋白質(zhì)代謝而緩解疲勞。

2.4 白藜蘆醇對運動后大鼠肝、肌糖原的影響

運動耐力強弱與能量儲存及供應(yīng)密切相關(guān)。糖原作為能量的重要來源，用于補充運動期間的血糖消耗，并維持血糖穩(wěn)定在生理范圍內(nèi)。劇烈運動時，首先肌糖原被耗盡，接著肝糖原氧化分解產(chǎn)生葡萄糖來提供血糖；當(dāng)肝糖原被耗盡時會發(fā)生體力疲勞[18]。增加糖原的儲存或減少糖原的消耗可提高運動耐力，延遲疲勞的發(fā)生。白藜蘆醇對運動后大鼠肝、肌糖原的影響見圖4。

圖4 白藜蘆醇對運動后大鼠肝、肌糖原的影響Fig.4 Effects of resveratrol on the liver and muscular glycogen of rats

由圖4可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）肝、肌糖原含量顯著增加（p＜0.05），肝糖原增加率分別為28.27%、57.24%、69.16%；肌糖原增加率分別為27.58%、37.07%、47.41%。這說明，白藜蘆醇能改善運動代謝控制和能量代謝活化，通過增加肝、肌肉糖原的儲存來改善體力疲勞。

2.5 白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織抗氧化酶的影響

劇烈運動造成耗氧量增加，產(chǎn)生大量活性氧（ROS）與自由基，導(dǎo)致體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)動態(tài)平衡發(fā)生紊亂產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過量的ROS與自由基能攻擊細胞膜、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等，造成氧化損傷。此外，ROS不僅能直接影響能量供應(yīng)和興奮-收縮偶聯(lián)過程中的酶活性，而且還加速BLA和SUN的積累[19]。正常情況下，機體有酶和非酶抗氧化劑這兩種主要的內(nèi)源性防御系統(tǒng)，能減少ROS與自由基的有害作用，降低氧化應(yīng)激。SOD、GPx、CAT是機體內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD是超氧自由基清除因子，能將O2-·轉(zhuǎn)化為H2O2；GPx將H2O2或氫過氧化物還原成H2O和醇；CAT能催化H2O2分解成H2O和O2[20]。但這些抗氧化酶在疲勞和其他疾病狀況下會發(fā)生減弱現(xiàn)象。白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織抗氧化酶的影響見圖5。

圖5 白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織抗氧化酶的影響Fig.5 Effects of resveratrol on the antioxidant enzyme in liver of rats

由圖5可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）SOD與GPx含量顯著增加（p＜0.05），SOD增加率分別為22.19%、33.71%、36.55%；GPx增加率分別為12.98%、16.39%、25.60%。中、高劑量白藜蘆醇組（M-ReG、HReG）CAT含量顯著增加（p＜0.05），增加率分別為15.19%、22.88%；低劑量白藜蘆醇組（L-ReG）CAT含量雖然也輕微增加，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。這說明，白藜蘆醇不僅能作為外源性抗氧化劑直接延緩疲勞，而且還能提高機體內(nèi)抗氧化酶活性，與內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來對抗氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗疲勞作用。

2.6 白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織丙二醛的影響

研究已經(jīng)證實，劇烈運動產(chǎn)生ROS與自由基會破壞線粒體功能，使其失去作為電子傳遞鏈組分的能力，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化發(fā)生并進一步造成氧化損傷[21]。丙二醛（MDA）是自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化主要產(chǎn)物，也是評價運動誘導(dǎo)氧化應(yīng)激最敏感的生物標志物之一[22]。白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織丙二醛的影響見圖6。

圖6 白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織丙二醛的影響Fig.6 Effects of resveratrol on the MDA in liver of rats

由圖6可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）MDA含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為18.21%、24.14%、28.07%。這說明，白藜蘆醇能減少自由基引起的脂質(zhì)過氧化，保護肝細胞膜完整性并維持肝臟正常生理狀態(tài)，進而提高運動耐力，促進疲勞恢復(fù)。

3 結(jié)論

白藜蘆醇具有抗疲勞作用，其能延長大鼠力竭跑步時間；降低BLA、BUN、肝組織中MDA含量；增加肝糖原、肌糖原以及肝組織中SOD、GPx、CAT含量。白藜蘆醇抗疲勞作用機理其機制可能與以下因素有關(guān)：

1）白藜蘆醇能降低代謝產(chǎn)物的堆積或快速清除代謝產(chǎn)物來延緩疲勞。

2）白藜蘆醇能改善運動代謝控制和能量代謝活化，通過增加肝、肌肉糖原的儲存來改善疲勞。

3）白藜蘆醇能提高體內(nèi)抗氧化酶活性，與內(nèi)源性抗氧化劑形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來降低氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗疲勞作用。

4）白藜蘆醇能減少自由基引起的脂質(zhì)過氧化，保護肝細胞膜完整性并維持肝臟正常生理狀態(tài)，進而提高運動耐力，促進疲勞恢復(fù)。