益母草堿調(diào)控成纖*維細(xì)胞內(nèi)EGF蛋白表達(dá)及對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

★ 肖亮 楊軍平 黎秋如 王瑩*（.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 南昌 330006；.樟樹(shù)市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 江西 宜春 3300）

據(jù)流行病學(xué)研究表明，乳腺癌已成為女性患病率最高的惡性腫瘤之一。最近幾年來(lái)，乳腺腫瘤相關(guān)的基質(zhì)成纖維細(xì)胞介導(dǎo)乳腺腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及潛在治療靶點(diǎn)已成為基礎(chǔ)研究的新熱點(diǎn)。腫瘤微環(huán)境中，乳腺基質(zhì)成纖維細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化和激活成腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞［1-2］，隨后分泌大量活性因子維持乳腺腫瘤微環(huán)境的內(nèi)部狀態(tài)、調(diào)控乳腺腫瘤的發(fā)生［3］、發(fā)展及遷徙［4-5］。而在乳腺腫瘤微環(huán)境內(nèi)，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）早已被證實(shí)與基質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞密切相關(guān)［6-7］。

中醫(yī)藥學(xué)從古至今，在治療和預(yù)防乳腺疾病包括乳腺腫瘤等方面都具有非常重要的作用［8-9］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)益母草對(duì)乳腺癌具有抑制功效［10-11］。

本研究通過(guò)建立成纖維細(xì)胞（ESF-1）與乳腺癌細(xì)胞（BT474）體外共培養(yǎng)模型，益母草堿（leonurine）干預(yù)后，觀察ESF-1細(xì)胞內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的表達(dá)及對(duì)BT474細(xì)胞增殖的影響，希望為益母草的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為乳腺腫瘤的臨床治療與基礎(chǔ)研究開(kāi)拓新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本實(shí)驗(yàn)為細(xì)胞生物學(xué)體外實(shí)驗(yàn)，人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株（BT474）購(gòu)買于中科院（上海）生命科學(xué)研究院細(xì)胞中心（No.TCHu143）；人表皮成纖維細(xì)胞（ESF-1）購(gòu)買于中科院（北京）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心（No.3111C0001-CCC000108）；實(shí)驗(yàn)于2017年1月—2018年5月于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.2 儀器與試劑 Transwell共培養(yǎng)小室（0.4um）購(gòu)自于Fisher Scientific公司；快速總RNA提取試劑盒套裝購(gòu)自于Generay公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Fast Quant RT Kit（with gDNase）購(gòu)自于TIANGEN公司；qPCR試劑IQ SYBR Green Supermix購(gòu)自Bio-Rad公司；DMEM-H培養(yǎng)基購(gòu)自于GIBCO公司；EGF引物購(gòu)自于上海吉瑪生物公司；Human EGF ELISA Kit購(gòu)自于R&D Systems公司；cck-8試劑盒購(gòu)自于日本同仁公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞共培養(yǎng) 利用通透性佳的Transwell小室，將ESF-1細(xì)胞和BT474細(xì)胞分別均勻接種于小室的上下兩面，因培養(yǎng)液的相互流動(dòng)從而達(dá)到細(xì)胞共培養(yǎng)的目的。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞共培養(yǎng)

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及益母草堿藥物干預(yù) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ESF-1細(xì)胞接種于下室、BT474細(xì)胞接種于上室；實(shí)驗(yàn)分組為ESF-1組，ESF-1/BT474共培養(yǎng)組，ESF-1/BT474藥物干預(yù)組（ESF-1/BT474+leonurine）；待接種細(xì)胞貼壁后，藥物干預(yù)組加入益母草堿濃度為10umol/孔，藥物濃度參考于相關(guān)文獻(xiàn)［12］及前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 ESF-1細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子（EGF）表達(dá)的檢測(cè) 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞共培養(yǎng)或單獨(dú)培養(yǎng)24h、48h后，利用qRT-PCR方法測(cè)定ESF-1細(xì)胞中EGF mRNA的水平。EGF引物為：上游5' CAA AAC GCCGAAG ACT TACC 3'；下游 5' GAC CAT CCA GAG CCA GACAC 3'；共培養(yǎng)或單獨(dú)培養(yǎng)48h、72h后，利用ELISA方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中EGF的蛋白濃度。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)BT474細(xì)胞增殖 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESF-1細(xì)胞及BT474細(xì)胞分別接種在Transwell小室的上下面，實(shí)驗(yàn)分組為BT474組、BT474藥物干預(yù)組（BT474+leonurine）、ESF-1/BT474共培養(yǎng)組、ESF-1/BT474藥物干預(yù)組（ESF-1/BT474+leonurine），均勻鋪呈，每孔約2×105個(gè)/mL，培養(yǎng)或共培養(yǎng)24h、48h、72h后，CCK-8法檢測(cè)BT474細(xì)胞增殖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS Statistics 17.0軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處，利用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果；利用t檢驗(yàn)及多重方差分析兩組別之間的差異，P＞0.05為無(wú)顯著差異，P＜0.05為顯著差異；PCR數(shù)據(jù)采用 Bio-Rad CFX Manager軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 ESF-1細(xì)胞內(nèi)EGF的表達(dá)水平

2.1.1 各實(shí)驗(yàn)組ESF-1細(xì)胞內(nèi)EGF mRNA的表達(dá)水平 各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)或共培養(yǎng)24h、48h后，利用qRT-PCR檢測(cè)ESF-1細(xì)胞內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。見(jiàn)表1。相對(duì)于ESF-1實(shí)驗(yàn)組，ESF-1/BT474共培養(yǎng)組中ESF-1細(xì)胞內(nèi)EGF 的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；而相對(duì)于ESF-1/BT474共培養(yǎng)組ESF-1/BT474藥物干預(yù)組（ESF-1/BT474+leonurine）中，ESF-1細(xì)胞內(nèi)EGF的mRNA的表達(dá)水平明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 24h、48h后各實(shí)驗(yàn)組EGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平（2-ΔΔCt）

2.1.2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)EGF蛋白的表達(dá) 單獨(dú)培養(yǎng)或共培養(yǎng)48h、72h后，利用ELISA方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的濃度水平（表2）。相對(duì)于ESF-1組，ESF-1/BT474共培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）濃度表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；而相對(duì)于ESF-1/BT474共培養(yǎng)組ESF-1/BT474藥物干預(yù)組（ESF-1/BT474+leonurine）中細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）濃度明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 48h、72h后各組培養(yǎng)液內(nèi)EGF濃度

2.2 益母草堿對(duì)乳腺癌BT474細(xì)胞增殖的影響單獨(dú)培養(yǎng)或共培養(yǎng)24h、48h、72h后，利用CCK-8法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組中BT474細(xì)胞的增殖情況。見(jiàn)表3。單獨(dú)培養(yǎng)或共培養(yǎng)24h，各實(shí)驗(yàn)組BT474細(xì)胞增殖情況未見(jiàn)顯著差別（P＞0.05）；培養(yǎng)或共培養(yǎng)48h后，相較于BT474組，各實(shí)驗(yàn)組BT474細(xì)胞增殖情況也無(wú)顯著差別（P＞0.05），但相較于BT474藥物干預(yù)組（BT474+leonurine），ESF-1/BT474組內(nèi)BT474細(xì)胞增殖加快，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.05）；培養(yǎng)或共培養(yǎng)72h后，相較于BT474組，BT474藥物干預(yù)組（BT474+leonurine）內(nèi)BT474細(xì)胞增殖減少有明顯差別（P＜0.05）；相較于ESF-1/BT474組，ESF-1/BT474藥物干預(yù)組（ESF-1/BT474+leonurine）內(nèi)BT474細(xì)胞增殖減少有明顯差別（P＜0.05）。

表3 各組BT474細(xì)胞增殖情況（OD值）

3 討論

益母草在臨床上應(yīng)用廣泛，相關(guān)研究早已證實(shí)益母草對(duì)乳腺癌具有抑制功效［10-11］，其主要藥效物質(zhì)益母草堿具有多種生物學(xué)功能，可通過(guò)下調(diào)腫瘤壞死因子TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS的表達(dá)并且上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK的表達(dá)，從而對(duì)乳腺炎發(fā)揮明顯的抗炎作用［13］；益母草堿還能通過(guò)調(diào)控ROS的水平及NF-κB、MMP-2、TNF-α的表達(dá)發(fā)揮減少急性腎損傷［14］、抗細(xì)胞纖維化［15］、抗炎癥［16］等多種生物學(xué)功能。

表皮生長(zhǎng)因子（EGF）是一種單鏈多肽，含有53個(gè)氨基殘基，能通過(guò)結(jié)合EGF受體啟動(dòng)一系列的信號(hào)傳遞從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能，并且與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［17］。

本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，探討與乳腺腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境中，成纖維細(xì)胞內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的變化及益母草堿干預(yù)的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與ESF-1細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，ESF-1/BT474共培養(yǎng)組成纖維細(xì)胞ESF-1內(nèi)EGF的mRNA、蛋白水平表達(dá)均升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，與乳腺腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)能上調(diào)成纖維細(xì)胞內(nèi)EGF蛋白的表達(dá)；另與ESF-1/BT474共培養(yǎng)組比較，ESF-1/BT474藥物干預(yù)組（ESF-1/BT474+leonurine）中ESF-1細(xì)胞內(nèi)mRNA、蛋白表達(dá)明顯減少，說(shuō)明益母草堿能有效抑制共培養(yǎng)環(huán)境中成纖維細(xì)胞ESF-1內(nèi)EGF的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)CCK-8法測(cè)定了各研究組中乳腺腫瘤BT474細(xì)胞的增殖情況。單獨(dú)培養(yǎng)或共培養(yǎng)24h后，各實(shí)驗(yàn)組BT474細(xì)胞增殖情況未見(jiàn)明顯差別，可能因?yàn)闀r(shí)間過(guò)短，乳腺癌BT474細(xì)胞還大都未進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期；培養(yǎng)或共培養(yǎng)72h后，相較于BT474組，BT474藥物干預(yù)組（BT474+leonurine）內(nèi)BT474細(xì)胞增殖減慢（P＜0.05），說(shuō)明益母草堿能有效抑制乳腺癌BT474細(xì)胞的增殖；培養(yǎng)或共培養(yǎng)48h后，相較于BT474藥物干預(yù)組（BT474+leonurine），BT474組內(nèi)BT474細(xì)胞增殖無(wú)明顯差別（P＞0.05），，可能益母草堿藥物作用還未完全顯現(xiàn)，但與之相比，ESF-1/BT474組中BT474細(xì)胞增殖有明顯差別（P＜0.05），說(shuō)明與益母草堿能夠抑制乳腺癌BT474細(xì)胞的增殖不同，EGF可能與乳腺癌BT474細(xì)胞的增殖具有正相關(guān)性。

4 結(jié)論

綜上結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用細(xì)胞共培養(yǎng)模型，研究乳腺癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的相互影響及益母草堿的干預(yù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與乳腺腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，能上調(diào)成纖維細(xì)胞內(nèi)EGF的表達(dá)，同時(shí)與乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖可能具有正相關(guān)性；且實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，益母草堿能下調(diào)成纖維細(xì)胞內(nèi)EGF的表達(dá)并抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖。這為本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)研究共培養(yǎng)環(huán)境中，益母草堿調(diào)控成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化提供了非常有力的支持，也為益母草在乳腺腫瘤的臨床治療上提供新的參考和理論依據(jù)。