登革熱病毒(DENV)包膜蛋白特異性人源抗體篩選與鑒定

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登革病毒(DENV)屬于黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，以埃及伊蚊和白紋伊蚊為傳播媒介。DENV基因組全長約10～11 kb，只有1個開放讀碼框，共編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白: 衣殼蛋白(C)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白( non-structuralprotein，NS1～NS5)[1-2]。DENV包膜(E)蛋白由3個結(jié)構(gòu)域組成：E蛋白結(jié)構(gòu)域1(ED1)是中心結(jié)構(gòu)域，ED2是二聚化結(jié)構(gòu)域并含有保守的融合環(huán)，ED3是推定的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域[3]。 E蛋白占據(jù)病毒表面的大部分并且是體液免疫應(yīng)答靶向的主要抗原[1, 4]。使用小鼠單克隆抗體進(jìn)行的表位研究已經(jīng)在E蛋白的表面上鑒定了至少12個不同的表位，其中 ED3上的表位能夠激發(fā)起有效的中和抗體[4]。其中4種血清型(DENV1-4)的感染可導(dǎo)致患者出現(xiàn)輕度登革熱發(fā)熱、嚴(yán)重的登革熱出血熱和登革熱休克綜合征等癥狀，有些則成為無癥狀感染者[5-6]。DENV感染主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)流行，在美洲、東地中海、東南亞和西太平洋地區(qū)報告的發(fā)病率最高。大多數(shù)登革熱流行都是由單一血清型病毒引起的，偶有報道由兩種或更多血清型引起流行[7]。 DENV的4種血清型也可以在同一地區(qū)引起登革熱流行病，已有報道我國廣東省暴發(fā)過4種DENV血清型的流行，其中以DENV-1流行為主[8-10]。在過去的幾十年，全球約有4億人每年感染登革熱病毒，其中約有1億人出現(xiàn)不同程度的癥狀[11]。在醫(yī)療保健系統(tǒng)發(fā)達(dá)的國家中，登革熱的死亡率非常低。然而，登革熱的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)很高，最近估計登革熱治療的全球成本為每年80億至90億美元[12]四價減毒活疫苗(Dengvaxia)已經(jīng)成在許多國家獲得許可[13]。然而，登革熱血清陰性的接種人群，在之后的登革熱感染時會出現(xiàn)明顯的病情加重，事實(shí)上，這種疫苗現(xiàn)在已在菲律賓停止使用。因此，需要針對該病毒的有效治療方法。

抗體治療正在成為一種針對病毒感染的潛在治療方法。例如帕利珠單抗，其是人源化的小鼠單克隆抗體，基于兒童的臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其顯著降低由于RSV感染而住院的風(fēng)險[14]。目前，多種技術(shù)手段都可應(yīng)用于人源單克隆抗體篩選，其中記憶B細(xì)胞分離后培養(yǎng)及單細(xì)胞PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛[15-17]。此外，記憶B細(xì)胞永生化技術(shù)也發(fā)展的十分迅速，已經(jīng)成功應(yīng)用到腫瘤特異性抗體的篩選中。近期的研究中，通過應(yīng)用登革熱疫苗接種者或病毒天然感染者的漿細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞PCR，成功篩選得到多種人源登革熱病毒特異性單克隆抗體，具有應(yīng)用于臨床治療的潛力[18-19]。在本研究中，我們使用流式細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)篩選得到登革熱感染者外周血單核細(xì)胞中的抗原特異性記憶B細(xì)胞，通過單細(xì)胞PCR技術(shù)獲得抗體基因序列，在此基礎(chǔ)上純化表達(dá)獲得了6株特異性人源抗體。對獲得的抗體性質(zhì)進(jìn)行了初步的鑒定，為開發(fā)高效的登革熱檢測方法及治療藥物提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例 該感染者在2014年廣州市登革熱暴發(fā)流行中被確診, 于確診后40 d采集外周血樣本10 mL于抗凝采血管中。通過梯度密度離心分離外周單核細(xì)胞(PBMC)，儲存于液氮中備用。4種型別重組E蛋白為本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)。

1.1.2主要試劑 常用質(zhì)粒pMD18-T、pTT-5為實(shí)驗(yàn)室保存，其中pTT-5載體已構(gòu)建抗體輕重鏈恒定區(qū)，用于抗體表達(dá)；常用菌株如DH5α、Top10購自Tiangen公司；細(xì)胞株BHK-21、293Expi購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS磷酸鹽緩沖鹽溶液、青霉素、鏈霉素均購于美國Hyclone公司。樣品的核酸和質(zhì)粒提取試劑購自QIAGEN公司；羊抗人IgGHRP(Fab specific)購自PIERCE公司；Live/dead-Aqua、CD3-PeCy7、CD20-FITC、CD27-PE、IgG-BV421及鏈親和素偶聯(lián)的APC等染色用熒光抗體購自BD公司，DENV-1 E蛋白生物素化試劑購自Thermo公司?？贵w純化介質(zhì)購自GE公司；DNA、Protein Marker購自Thermo公司。

1.1.3Nested-PCR引物 本研究所涉及的引物均由Invitrogen公司合成，具體引物設(shè)計方案參照文獻(xiàn)[16]。

1.2 方法

1.2.1單細(xì)胞分選 采集2014年廣州市登革熱暴發(fā)流行中被確診的感染者外周血10 mL，采用常規(guī)Ficoll-Paque密度梯度離心，獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。采用Live/dead、CD3、CD20、CD27、IgG、IgM和DENV-1 E-biotin這6個指標(biāo)對抗原特異的記憶B細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，經(jīng)BD AriaⅢ分選型流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和單細(xì)胞分選，用96孔U底細(xì)胞板進(jìn)行細(xì)胞收集。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄PCR 在96孔PCR板中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。配置14 μL逆轉(zhuǎn)錄體系，各組分加入量為：150 ng隨機(jī)引物(pd(N)6, GE Healthcare)、0.5 μL dNTP(Invitrogen)、0.5%Igepal CA-630 (Sigma)、4 U RNAsin (Promega)、6 U Prime RNAseInhibitor (Eppendorf) 和50 U Superscript○RIII reverse transcriptase (Invitrogen)，42 ℃，10 min；25 ℃，10 min; 50 ℃，60 min；94 ℃，5 min。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將PCR板保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3Nested-PCR 通過Nested-PCR 對IgH,Igλ和Igκ可變區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為40 μL，各組分夠成為：cDNA 3.5 mL、20 nmol/L各引物、300 nMdNTP (Invitrogen) 和 1.2 UHotStar○ RTaq DNA polymerase (Qiagen)。Nested-PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，30 s；58 ℃(IgH/Igκ) 或者 60 ℃(Igλ)，30 s；72 ℃，55 s (第一輪PCR) 或者45 s (第二輪PCR)；循環(huán)數(shù)50。應(yīng)用2%瓊脂糖核酸電泳，對Nested-PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定及回收。

1.2.4PCR產(chǎn)物純化和克隆鑒定 Nested-PCR產(chǎn)物片段大小為500 bp，使用TIANGEN回收試劑盒純對鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后克隆至pMD18-T載體。每個PCR產(chǎn)物挑取5個菌斑進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行基因測序。

1.2.5抗體基因序列分析 將測序結(jié)果用MEGA 7讀取，并將測序結(jié)果正確的序列在IMGT數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行重鏈以及輕鏈的家系及突變情況等分析。

1.2.6抗體的表達(dá)及純化 對純化得到的重鏈及輕鏈可變區(qū)分別構(gòu)建酶連位點(diǎn)，將來自每個單細(xì)胞的抗體可變基因的擴(kuò)增cDNA克隆到含有人IgG1或Igκ恒定區(qū)的表達(dá)載體中，構(gòu)建不同輕重鏈表達(dá)克隆，重組表達(dá)IgG1亞型抗體[20]。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(11668-019，Invitrogen)，用等量的編碼重鏈和輕鏈的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293Expi細(xì)胞。培養(yǎng)5 d后，收集含有抗體的細(xì)胞上清，并使用Protein A介質(zhì)(17-1279-03，GE Healthcare)進(jìn)行純化。

1.2.7抗體結(jié)合活性測定 通過不同型別重組E蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，對單克隆抗體與不同血清型DENV的結(jié)合活性進(jìn)行檢測。包被E蛋白(DENV-1:228-11688, DENV-2:228-11689, DENV-3:228-11690, DENV-4:228-11691; RayBiotech)200 ng每孔于ELISA板，4 ℃過夜保存。然后每孔中加入200 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃下孵育2 h進(jìn)行封閉。呼吸道合胞病毒(RSV)特異性人源單克隆抗體作為陰性對照抗體，其與待檢測單克隆抗體以初始濃度為30 μg/mL進(jìn)行4倍倍比梯度稀釋，然后加入100 μL各濃度，并在37 ℃下孵育1 h。PBS-Tween洗滌3次，加入羊anti-人IgG抗體(1∶5000，v/v)，37 ℃下孵育1 h，PBS-Tween洗滌3次。加入顯色底物，37 ℃孵育15 min，終止顯色并讀取吸光度參數(shù)。根據(jù)讀值，計算其抗體與抗原的結(jié)合活性。

1.2.8蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)測定抗體中和活性 將BHK-21細(xì)胞(5×105細(xì)胞/mL，2 mL培養(yǎng)基)接種于6孔板中，37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。然后加入單克隆抗體-病毒混合液于BHK-21細(xì)胞單層中，37 ℃下孵育1 h。棄去培養(yǎng)上清液，加入800 μL 1.2%營養(yǎng)甲基纖維素，37 ℃下培養(yǎng)4～5 d。空斑形成后，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，觀察斑塊形成。匯總數(shù)據(jù)分析不同抗體中和活性。

2 結(jié) 果

2.1DENV-1特異性記憶B細(xì)胞分選 為了獲得天然的輕重鏈抗體配對，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞分選系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)單個B細(xì)胞高效分選。本研究中分析的樣本來源于2014年廣東省登革熱感染者，應(yīng)用CD3、CD20、CD27、IgG、IgM及DENV-1 E蛋白等指標(biāo)實(shí)現(xiàn)對PBMC中B細(xì)胞亞群的具體分析。記憶B細(xì)胞作為體液免疫應(yīng)答的重要組成，成熟記憶細(xì)胞表面的BCR具有很強(qiáng)的抗原結(jié)合能力且長期存在于外周血中，因此本研究也選擇記憶B細(xì)胞作為獲得DENV抗原特異性單克隆抗體基因的來源。

分析結(jié)果表明，外周血中成熟記憶B細(xì)胞(Aqua-/CD3-/CD20+/CD27+/IgG+)中DENV E蛋白特異性成熟記憶B細(xì)胞占比為0.32%，如圖1。從10 mL外周血的單核細(xì)胞中共分選得到110個特異性單B細(xì)胞，用于后續(xù)的單細(xì)胞PCR。

2.2抗體表達(dá)與結(jié)合活性檢測 抗體輕重鏈可變區(qū)為抗原特異性識別區(qū)域，通過獲取該區(qū)域基因序列信息實(shí)現(xiàn)對抗體的序列進(jìn)行分析及表達(dá)鑒定。已經(jīng)廣泛使用的單細(xì)胞PCR技術(shù)能夠?qū)gH、Igλ和Igκ的可變區(qū)基因進(jìn)行高效擴(kuò)增。研究中單細(xì)胞PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，顯示在分選得到的110個DENV特異性B細(xì)胞中成功調(diào)取重鏈的有55個，成功率為50%,輕鏈的有70個(48個Kappa型,22個lambda型)，成功率為63.6%。共得到24株抗體輕重鏈基因配對，配對成功率為21.8%。采用Gibson裝配方法將配對抗體輕重鏈可變區(qū)序列構(gòu)建到含有人源IgG1或Igκ恒定區(qū)的表達(dá)載體中。經(jīng)過酶切鑒定及序列比對，最終成功構(gòu)建24株抗體的表達(dá)克隆。配對抗體輕重鏈表達(dá)質(zhì)粒等量轉(zhuǎn)染到293Expi真核表達(dá)細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)5 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。經(jīng)過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)鑒定，其中6株為DENV特異性單克隆抗體。通過Protein A介質(zhì)對IgG1抗體進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物經(jīng)離心濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果如圖2，各抗體的輕重鏈均可很好的表達(dá)，重鏈分子量大小為50 kD左右，輕鏈分子量大小為25 kD左右，與正常大小相符合。

圖1 DENV特異IgG+記憶B細(xì)胞群分析Fig.1 Analysis of DENV-specific IgG+memory B cells

圖3 應(yīng)用ELISA方法對抗體反應(yīng)性進(jìn)行檢測Fig.3 Reactivity test of DENV-specific antibodies

圖4 測定各抗體對不同亞型DENV的中和活性Fig.4 Neutralization test of DENV-specific antibodies

圖2 SDS-PAGE凝膠電泳分析抗體輕重鏈表達(dá)Fig.2 Antibodies were characterized by SDS-PAGE

通過重組E蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，對單克隆抗體與不同血清型DENV E 蛋白的結(jié)合活性進(jìn)行了檢測，對EC50進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果如圖3，這6株單克隆抗體具有DENV結(jié)合活性，其均為DENV-1 E蛋白特異性單克隆抗體，在高濃度下與DENV-2 E 蛋白具有很弱的結(jié)合。在6株單克隆抗體中，4株單抗N-1、N-2、N-3和N-6具有與DENC-1 E蛋白相近的結(jié)合活性，EC50分別為0.006 9 μg/mL、0.006 8 μg/mL、0.005 4 μg/mL和0.006 5 μg/mL。此外，N-4與N-5的結(jié)合活性較差，N-5的EC50為2.06 μg/mL，這應(yīng)該與其識別表位的差異性或者抗體成熟度不夠有關(guān)。

2.3抗體中和活性檢測 通過蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)測定各抗體中和活性，結(jié)果如圖4。因?yàn)楹Y選得到的單克隆抗體為DENV-1特異性單克隆抗體，所以其只對DENV-1病毒具有中和活性，對其他亞型均無中和能力。普遍認(rèn)為中和活性與結(jié)合活性之間具有一定的相關(guān)性，本研究的中和結(jié)果也說明了這一觀點(diǎn)。6株抗體中強(qiáng)結(jié)合活性的N-1、N-2、N-3和N-6均表現(xiàn)出很強(qiáng)的中和DENV-1病毒的能力，其PRNT50分別為0.01 μg/mL、0.014 μg/mL、0.014 μg/mL和0.023 μg/mL。結(jié)合活性最差的N-5單克隆抗體PRNT50為21.24 μg/mL。

2.4抗體可變區(qū)基因分析 配對抗體輕重鏈可變區(qū)基因序列上傳至IMGT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對并分析。24株抗體輕重鏈V區(qū)基因與人源抗體原始家系一致性均達(dá)到90%以上，說明調(diào)取的抗體基因未出現(xiàn)其他物種基因污染。驗(yàn)證為DENV-1 E蛋白特異性的6株單克隆抗體的輕重鏈基因序列分析結(jié)果見表1，其重鏈V基因家系為1-69、5-51和4-30，輕鏈V基因家系來源為2-14、3-15、1-51、1-39和1-47。與結(jié)合活性結(jié)果共同分析可以發(fā)現(xiàn)，高結(jié)合活性的N-1、N-2、N-3和N-64株單抗均來源于1-69家系。同時這4株單抗均有相似的CDR3氨基酸序列，可能識別相同的E蛋白抗原表位，且通過結(jié)合該表位能夠高效的抑制病毒對細(xì)胞的感染。

A

表1 不同抗體的輕重鏈VDJ基因家系及CDR3氨基酸序列分析Tab.1 Analysis of VDJ gene family of light and heavy chains with different antibodies，which was accessible from IMGT

B

A:重鏈分析；B:輕鏈分析

3 討 論

治療性單克隆抗體的商業(yè)開發(fā)在20世紀(jì)80年代初開始，目前單克隆抗體藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療多種疾病，范圍從呼吸道合胞病毒感染，到某些癌癥和多發(fā)性硬化癥，甚至哮喘和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[21-23]。在過去25年，超過30種IgG及其衍生物已被批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用[24]。隨著研究者對治療性單克隆抗體研究的不斷深入，其在治療多種病毒的感染中發(fā)揮越來越重要的作用，尤其在呼吸道合胞病毒的治療應(yīng)用中[25-26]。近幾年，新興的單個 B 細(xì)胞抗體制備技術(shù)是一種體外克隆和表達(dá)單個抗原特異性 B 細(xì)胞抗體基因技術(shù)，這種方法保留了輕重鏈可變區(qū)的天然配對，具有基因多樣性好、效率高、全人源、需要的細(xì)胞量少等優(yōu)勢[15, 17, 27]。

本研究主要通過應(yīng)用抗原特異IgG+記憶B細(xì)胞流式篩選平臺，對DENV感染者PBMC中的E蛋白特異IgG+記憶B 細(xì)胞進(jìn)行分選。通過單細(xì)胞PCR共得到24對輕重鏈配對抗體基因，經(jīng)過表達(dá)后鑒定，其中6株單克隆抗體為E蛋白特異性的人源單克隆抗體。篩選得到的單克隆抗體與4種亞型的E蛋白結(jié)合活性存在明顯差異，與DENV-1 E蛋白的結(jié)合活性最強(qiáng)。蝕斑減少中和試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，篩選得到的單克隆抗體對DENV-1均具中和活性。其中N-1、N-2、N-3和N-6的DENV-1 病毒中和能力最強(qiáng)，該4株均來源于1-69基因家系，具有相似的CDR3氨基酸序列，識別DENV-1 E蛋白上某一表位發(fā)揮很強(qiáng)的病毒中和能力。本研究在抗原特異性記憶B細(xì)胞中，成功篩選出具有高中和活性的抗DENV-1人源單克隆抗體。這些抗體不僅能夠作為開展DENV研究的重要工具，而且也可能成為用于開發(fā)診斷及臨床治療的重要單克隆抗體。