弓形蟲感染對THP-1巨噬細胞極化影響的研究

劉學雷，王云杰，楊寧愛，安童童，康宇婷，賈 偉，蘇雅靜，趙志軍

弓形蟲是一種專性的胞內寄生蟲，能導致嚴重弓形蟲病，在世界的不同地理區(qū)域有大量的人口感染弓形蟲，在免疫抑制或者懷孕的婦女會產生嚴重的后果,例如：流產、產后的畸形以及新生兒的死亡[1-2]。巨噬細胞是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要細胞模型，當受到外界環(huán)境諸多病原體刺激時表型和功能會發(fā)生變化，這種現(xiàn)象稱為巨噬細胞極化[3]。巨噬細胞極化主要分為M1型和M2型，M1型主要分泌促炎因子，M2型主要分泌抑制炎癥的因子[4-5]。弓形蟲作為一種嚴格的細胞內寄生蟲，可侵入所有的哺乳動物的有核細胞。巨噬細胞是人體內重要的免疫細胞，RH株弓形蟲感染后會引起巨噬細胞的免疫應答。巨噬細胞作為一種免疫細胞應起到控制弓形蟲感染與增殖的作用，但是有文獻已經報道弓形蟲可感染大鼠的巨噬細胞并且在內部增殖[6-7]。弓形蟲是否利用巨噬細胞極化而實現(xiàn)感染與增殖很值得我們探究。

本研究擬使用人單核細胞系THP-1經佛波酯(PMA)誘導后分化為M0型巨噬細胞， M0型巨噬細胞表達的蛋白偏向M1型巨噬細胞，這種巨噬細胞模型在國內外已經應用普遍，因此運用THP-1的細胞模型來研究弓形蟲對巨噬細胞的極化是可行的[8-9]。通過Diff染色、Western blot、Q-PCR等方法研究弓形蟲感染THP-1細胞后極化相關蛋白和基因的表達情況。探究弓形蟲RH株感染對THP-1巨噬細胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 弓形蟲RH株為本實驗室保存的；THP-1單核細胞系購自中國科學院上海細胞生物研究所；佛波酯(PMA)購自索萊寶公司;胎牛血清購自BI公司；培養(yǎng)基1640購自GIBCO公司；Trizol購自ambion公司；反轉錄試劑盒購自Thermo公司;熒光定量PCR試劑購自Roche公司；兔抗人誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體、兔抗人精氨酸酶-1(Arginase-1)抗體、HPR標記山羊抗兔IgG(IgG-HRP)購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) THP-1細胞復蘇以后，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，1∶3進行傳代。

1.2.2THP-1細胞的誘導 THP-1細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿內，每皿細胞約4×106個。PMA的濃度保持在100 ng/mL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h誘導THP-1細胞為貼壁的巨噬細胞。

1.2.3弓形蟲傳代 弓形蟲從液氮取出后于37 ℃水浴快速融化，取250 μL注入小鼠腹腔內。當小鼠出現(xiàn)蜷縮、背部毛發(fā)炸起、腹部膨脹后無痛斷頸處死小鼠。用酒精擦拭腹部皮膚，剪開長約1 cm的腹部皮膚，吸取PBS注入小鼠腹腔內輕柔腹部使PBS混勻，然后從中吸取100 μL注入健康小鼠腹腔內完成第一次弓形蟲的傳代。傳代3次后弓形蟲毒力穩(wěn)定可用于后續(xù)實驗。

1.2.4THP-1細胞感染 弓形蟲傳到3代以后從第四代開始可用于感染。無痛斷頸處死發(fā)病小鼠，75%酒精擦拭腹部皮膚，眼科剪剪開長約1 cm的腹部皮膚，注射PBS 5mL,輕柔腹部，混勻后抽出含有弓形蟲的PBS。1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加1640沖懸混勻，計數(shù)。THP-1細胞與弓形蟲1∶1感染。未加弓形蟲的作為對照組，感染弓形蟲的設1 h、12 h、18 h、24 h、36 h組，用于后續(xù)實驗。

1.2.5細胞爬片與Diff染色 收集含有THP-1細胞懸液，800 r/min,離心5 min;棄上清，加2 mL 1640沖懸混勻，計數(shù)。細胞數(shù)為1×106/孔接種于6孔板內 。每孔加10 μg/mL的 PMA 20 μL,使?jié)舛缺３衷?00 ng/mL。誘導48 h后感染弓形蟲。然后根據(jù)設的不同時間取出爬片，晾干，固定，Diff染液A液染30 s后PBS沖洗晾干，B液染15 s后去離子水沖洗晾干。

1.2.6LPS刺激THP-1細胞 THP-1細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿內，每皿細胞約4×106個，THP-1經PMA刺激48 h分化為巨噬細胞，LPS濃度分別為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1000 ng/mL刺激巨噬細胞24 h，收集細胞，提取蛋白。Western blot法檢測iNOS和Arg-1表達情況。

1.2.7蛋白免疫印跡 Western blot法檢測THP-1細胞感染弓形蟲后iNOS和Arg-1蛋白的表達情況 收集長在10 cm皿內的對照組、1 h、12 h、18 h、24 h、36 h的細胞(種植、誘導，感染的方法同前),提取總蛋白。采用BCA法檢測蛋白的濃度。進行10%SDS-PAGE電泳、轉模、以及封閉，分別用兔抗人iNOS和Arg-1(1∶2 000)以及兔抗人β-actin抗體(1∶2 000)在4 ℃孵育過夜，二抗孵育(山羊抗兔多克隆IgG抗體，工作液1∶5 000)2 h，發(fā)光液顯色后，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.2.8極化相關因子mRNA表達水平的檢測 通過Trizol 法提取細胞的總 RNA，TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA,通過 SYBR Green 熒光定量 PCR 測定不同時間點細胞中 iNOS 、 Arginase-1等 mRNA 水平表達情況。以 β-actin 作為內參基因，相對定量使用的方法是 2-ΔΔCt。所用引物見表 1。

表1 本研究中所用到的引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

2 結 果

2.1弓形蟲體外感染THP-1巨噬細胞 采用Diff染色并在顯微鏡下觀察弓形蟲在細胞內的增殖情況。THP-1細胞感染弓形蟲以后，1 h弓形蟲已經進入到細胞內，到18 h細胞內的弓形蟲明顯增值且感染細胞的數(shù)量也增多。24 h感染細胞明顯增多且有少部分蟲體已破細胞而出，36 h細胞基本被破壞且蟲體都破細胞而出，僅有少數(shù)有細胞形態(tài)的細胞殘存(圖1)。

2.2極化相關因子蛋白表達水平的檢測 PMA誘導后感染弓形蟲以并收集 1 h、12 h、18 h、24 h、36 h蛋白。Western blot檢測蛋白的iNOS和Arg-1蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，隨著時間的增加iNOS逐漸減少，36 h表達量最低。Arg-1在對照組、1 h、12 h無表達，18 h有少量表達，36 h Arg-1表達量明顯高于其他組，同時檢測了不同濃度的LPS對巨噬細胞iNOS和Arg-1表達量的影響。結果顯示Arg-1無表達，LPS濃度為100 ng/mL時iNOS的表達量最高(圖2、圖3)。

(A為經PMA誘導后正常的巨噬細胞：B、C、D、E、F分別為感染弓形蟲1 h、12 h、16 h、24 h、36 h后的巨噬細胞。紅色箭頭指示弓形蟲)圖1 PMA誘導后在不同時間點感染弓形蟲的情況(Diff染色×1000)Fig.1 Toxoplasma gondii infection at different time points following PMA induction (Diff staining×1 000)

圖2 PMA誘導組在不同感染時間點下蛋白的表達水平Fig.2 Protein expression level in PMA-induced group at different time points of infection

圖3 不同濃度LPS對蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of different concentrations of LPS on protein expression

2.3極化相關因子 mRNA 表達水平的檢測 檢測不同時間點M1極化標志因子IL-1、IL-12、TNF-α和iNOS mRNA以及M2極化標志因子IL-10、TGF-β、MIP-1和Arg-1 mRNA的相對表達量。PMA誘導并感染后M1極化相關因子隨著時間的與對照組相比逐漸降低，36 h表達量與對照組比較降低最明顯(t=3.313,P<0.05)。M2極化相關因子IL-10和Arg-1的表達量逐漸增加，到36 h表達量明顯高于其他組(t=9.587,P<0.05)。q-PCR和Werstern Blot的趨勢一致(圖4)。

3 討 論

根據(jù)弓形蟲對小鼠的致病力，將其分為高致病力(如Ⅰ型)和低致病力(Ⅱ型和Ⅲ型)蟲株[10]，不同蟲株感染宿主后引起的免疫反應也會不同。研究表明弓形蟲巨噬細胞系，Ⅰ(RH株、SH株等)和Ⅲ型主要通過釋放棒狀體激酶ROP16激活STAT6信號通路，巨噬細胞向M2方向極化，Ⅱ(ME49、QH株等)型主要通過釋放致密顆?？乖璆RA15激活NF-κβ通路使巨噬細胞向M1方向極化[1, 11]。M1型巨噬細胞會釋放iNOS(一氧化氮合成酶)，M2型巨噬細胞則釋放Arg-1(精氨酸酶Ⅰ)。iNOS和Arg-1都可以利用精氨酸分別產生NO和尿素。NO對弓形蟲的生長具有殺傷抑制作用，而弓形蟲可以利用尿素產生多胺類物質為自身的增殖提供營養(yǎng)。iNOS和Arg-1分別作為M1和M2型巨噬細胞的標志性蛋白。Zhao等人發(fā)現(xiàn)大鼠肺泡巨噬細胞在感染弓形蟲RH株后，高表達Arg-1[12]。弓形蟲RH株在感染小鼠骨髓源性巨噬細胞后發(fā)現(xiàn)蛋白Arg-1低表達，iNOS高表達[13]。

本實驗用弓形蟲RH株感染經人類THP-1巨噬細胞模型后發(fā)現(xiàn)，Arg-1的表達量在對照組和1 h和12 h時無表達，36 h表達量明顯高于其他時間點，而iNOS的表達量呈逐漸降低的趨勢，36 h表達量明顯低于其他組。弓形蟲RH株通過分泌ROP16調控宿主與巨噬細胞極化相關的信號通路基因表達，使巨噬細胞向M2方向極化，減少iNOS的生成，降低NO對自身的抑制和殺傷作用，增加多胺類物質的生成為弓形蟲增殖提供物質條件。THP-1體外感染弓形蟲RH株，Diff染色的結果我們發(fā)現(xiàn)弓形蟲在1 h和12 h細胞內的蟲體數(shù)量較少， 24 h細胞內的蟲體數(shù)量明顯增多，36 h細胞大多數(shù)被破壞，弓形蟲破膜而出。

通過對相關mRNA表達量檢測的結果發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細分泌的IL-1、IL-12、TNF-α等促炎因子的表達量明顯降低，M2型巨噬細胞分泌的IL-10、MIP-1等促炎因子表達量逐漸增加。弓形蟲RH株感染后可以通過減少巨噬細胞IL-1、IL-12、TNF-α等促炎因子的產生，降低炎癥對弓形蟲增殖的抑制作用。IL-12可刺激并且激活T細胞，促使Th0細胞向Th1細胞分化，Th1細胞可以增強吞噬細胞介導的抗感染免疫，特別是胞內病原菌的感染。弓形蟲通過調控IL-12基因的低表達，使IL-12因子生成減少以此降低宿主細胞對弓形蟲的免疫殺傷作用。IL-10又稱細胞因子生成抑制因子(CSIF)，已有研究表明IL-10可以抑制TNF-α的生成從而在抑制炎癥的發(fā)生和免疫平衡方面發(fā)揮重要作用[14]。M2型巨噬細胞分泌的MIP-1作為參與組織損傷修復的因子在弓形蟲感染后表達量明顯高于對照組，表明弓形蟲感染后會是巨噬細胞向M2型極化。有研究表明TGF-β可以起到抑制胞內殺傷弓形蟲速殖子的作用[15]。TGF-β作為一種抑制炎癥發(fā)生和加強組織修復的因子，巨噬細胞感染弓形蟲以后發(fā)現(xiàn)1 h mRNA的表達量高于對照組，在感染早期弓形蟲會促進TGF-β的高表達。Q-PCR的結果證明了弓形蟲RH株感染巨噬細胞后會抑制M1型相關因子mRNA的表達，促進M2型相關因子mRNA高表達。Q-PCR檢測iNOS和Arg-1 mRNA的表達量和WesternBlot結果一致。弓形蟲RH株會導致巨噬細胞向M2表型偏移。

在以往研究弓形蟲調控巨噬細胞的極化中多采用大鼠或者小鼠的巨噬細胞系模型。本研究中采用佛波酯誘導THP-1細胞，并且成功獲得了有懸浮細胞分化為貼壁巨噬細胞的模型；采用THP-1誘導成巨噬細胞的模型對研究弓形蟲RH株對人巨噬細胞的極化調節(jié)具有重要意義；從弓形蟲調控巨噬細胞極化的角度為弓形蟲病的防治提供一個前期研究基礎。