紫外-化學(xué)誘變篩選高產(chǎn)莫納可林K或色素的紅曲菌株

吳雙雙，劉文龍，鄧雪菲，石 鶴，馮艷麗*

（1.湖北師范大學(xué) 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002；2.湖北師范大學(xué) 生物學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，湖北 黃石 435002；3.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002）

紅曲菌又叫紅曲霉，是一種小型絲狀真菌，營腐生，屬真菌門（Eumycophyta），子囊菌綱（Ascomycetes），真子囊菌亞綱（Euascomycetes），散囊菌目（Eurotiales），紅曲菌科（Monascaceae）紅曲霉屬（Monascus）[1-2]。紅曲菌的種類有20多種，主要有紫色紅曲菌（Monascuspurpureus）、紅色紅曲菌（Monascus ruber）、叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）等[3]。紅曲菌是我國重要的藥食同源微生物，其發(fā)酵產(chǎn)物紅曲最早發(fā)現(xiàn)于中國，已有近兩千年的生產(chǎn)、應(yīng)用歷史。紅曲是由紅曲菌接種于大米經(jīng)發(fā)酵而來，在古代既是一種食品，又可做藥用[4-5]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，紅曲菌在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，其中主要的代謝產(chǎn)物有紅曲色素（Monascus pigments，MPs）、莫納可林K（Monacolin K，MK）、γ-氨基丁酸、麥角固醇等，部分紅曲菌還可產(chǎn)生真菌毒素——桔霉素[6-7]。上述代謝產(chǎn)物中，研究和應(yīng)用較為廣泛的為MPs和MK。

MPs具有熱穩(wěn)定性好，蛋白著色力強，對pH穩(wěn)定，安全無毒等特點，在食品工業(yè)中被用作天然食品著色劑[6-7]。MK是1979年日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章從紅色紅曲菌（Monascusruber）的發(fā)酵物中分離出來的活性物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，在膽固醇生物合成途徑中，羥甲基戊二酰單酰輔酶A（HMG-CoA）的還原酶是控制膽固醇合成的關(guān)鍵酶，而MK是這種酶的競爭性抑制劑，可以有效的減少或阻斷內(nèi)源性膽固醇的合成，調(diào)節(jié)人體的血脂血壓[8-10]。桔霉素是紅曲菌目前所發(fā)現(xiàn)的唯一一種真菌毒素，對腎臟有毒害作用，還可能誘發(fā)腫瘤，致畸，致突變等[11-13]，但并不是所有的紅曲菌都會產(chǎn)生桔霉素。

然而，桔霉素對紅曲類產(chǎn)品的污染嚴(yán)重影響了該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。篩選高產(chǎn)MPs及MK且不產(chǎn)或低產(chǎn)桔霉素的紅曲菌顯得尤為重要，而紫外誘變及化學(xué)誘變因操作簡便、效果好等原因得到廣泛應(yīng)用[14-15]。本研究以MS-1為出發(fā)菌株，采用紫外誘變、LiCl誘變及復(fù)合誘變的方法，篩選高產(chǎn)MPs和MK且遺傳穩(wěn)定的紅曲菌株。該研究結(jié)果對安全、高效的紅曲菌株篩選及應(yīng)用具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

叢毛紅曲菌（Monascuspilosus）MS-1（CCTCCM 2013295）：由紅曲產(chǎn)品中分離所得。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g切塊，加入1300mL的蒸餾水煮20 min，待土豆熟軟后經(jīng)4層尼龍布過濾，取濾液定容至1 L，加入20 g葡萄糖及20 g瓊脂粉攪拌溶解，分裝后于121℃滅菌20 min待用。

洛伐他汀抗性培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基中加入一定量的洛伐他?。╨ovastatin），使培養(yǎng)基中洛伐他汀的質(zhì)量濃度分別為1.1 mg/mL、1.3 mg/mL、1.5 mg/mL、1.7 mg/mL、1.9 mg/mL和2.1 mg/mL，滅菌待用。

種子培養(yǎng)基：在干凈的空三角瓶中加入葡萄糖80 g/L，蛋白胨10 g/L，NH4H2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，以土豆汁代替蒸餾水溶解上述藥品，定容后分裝滅菌，制成種子培養(yǎng)基待用。

固態(tài)培養(yǎng)基：優(yōu)化后的培養(yǎng)基米粉和豆粉比例為3∶2[17]，原始培養(yǎng)基為純米粉。將培養(yǎng)基加入250 mL三角瓶中，用蒸餾水溶解一定量的乙酸和MgSO4·7H2O，平均分裝后攪拌混勻，滅菌冷卻后再加入12.5 mL無菌水，使培養(yǎng)基初始含水量、乙酸含量及MgSO4·7H2O濃度分別為35%，6 g/L和0.004 mol/kg。

1.1.3 試劑

葡萄糖粉劑：重慶和平制藥有限公司；七水硫酸鎂、無水氯化鈣、無水氯化鋰、磷酸二氫銨、冰乙酸、蛋白胨、瓊脂粉、無水乙醇（均為分析純或生化試劑）、乙腈（色譜純）、磷酸（色譜純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。MK標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：阿拉丁公司；怡寶純凈水：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

BCM-1300A生物潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CP114電子天平：奧豪斯儀器有限公司；BSA2202S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-5100 B紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；Agilent 1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技有限公司；LRH-80生化培養(yǎng)箱、DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備

將紅曲菌MS-1接種于裝有PDA培養(yǎng)基的茄子瓶中，在30℃條件下靜置培養(yǎng)10 d。取15 mL無菌水洗脫上述茄子瓶中的紅曲菌孢子，倒入裝有玻璃珠的無菌錐形瓶內(nèi)，充分振蕩后經(jīng)3層無菌擦鏡紙過濾，制成均一的孢子懸液。根據(jù)需要將孢子懸液稀釋至105～106CFU/mL。

1.3.2 種子液培養(yǎng)及固態(tài)發(fā)酵

茄子瓶培養(yǎng)的紅曲菌，用15 mL無菌水洗脫菌絲，倒入帶有玻璃珠的無菌錐形瓶內(nèi)振蕩打散，吸取菌液加入種子培養(yǎng)基中，在130 r/min、30℃條件下培養(yǎng)36 h。固態(tài)發(fā)酵時，種子液接種量為130g/L，在30℃條件下培養(yǎng)2～3d，待培養(yǎng)基變紅后調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為25℃，培養(yǎng)至14 d。將培養(yǎng)好的紅曲米于55℃條件下烘干12 h后粉碎，制得紅曲粉末。

1.3.3 紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中色價的測定

采用紫外分光光度法測定紅曲產(chǎn)品的色價。取50mL離心管，加入0.3 g紅曲粉和10 mL體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，充分振蕩后超聲提取1 h，靜置15 min，分別取上層清液3 mL和4 mL于離心管，8 000 r/min離心10 min，放冰箱冷藏待用。取3 mL提取液，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇在波長505 nm處的吸光度值（OD值）為0作為對照組，調(diào)整紫外分光光度計，測定紅曲粉末中色素的吸光度。紅曲色素的色價計算公式如下：

1.3.4 紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中MK的測定

采用已優(yōu)化的高效液相色譜法檢測紅曲產(chǎn)品中MK[17-18]。取保存的4 mL提取液，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，經(jīng)孔徑0.22μm的有機濾膜過濾，用HPLC法測定MK含量。HPLC系統(tǒng)為Agilent1260，色譜柱為Inertsil ODS-3，流動相為乙腈∶水∶0.5%磷酸=60∶37∶3（V/V），流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長238 nm，進樣量20μL。紅曲樣品中MK含量的計算公式如下：

1.3.5 紫外條件下誘變紅曲菌

取5mL孢子懸液于無菌培養(yǎng)皿中，置于15 W紫外燈下15 cm處[19]，照射30 s。按10倍梯度稀釋法將經(jīng)UV處理過的孢子懸液依次稀釋至10-3～10-7濃度，立即浸入冰水中暗室保存15 min備用。

取稀釋至10-3～10-7冰浴后的誘變懸液0.5 mL于平板中，倒入冷卻至室溫的PDA培養(yǎng)基，搖勻冷卻，凝固后制成計數(shù)平板，倒置于30℃條件下培養(yǎng)4～5 d，每一濃度取三個平行。記錄平板菌落數(shù)，計算誘變致死率。

取稀釋到10-3～10-7冰浴后的誘變孢子懸液0.2 mL于平板中，倒入Lovastatin抗性培養(yǎng)基，搖勻冷卻制成Lovastatin抗性平板，每組3個平行，于30℃條件下避光培養(yǎng)4～5 d。挑取菌落生長速度較快的誘變菌落于試管培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)至茄子瓶擴培10 d。

在以上條件下，調(diào)節(jié)照射時間分別為60 s、90 s，進行紫外誘變，計算致死率。

1.3.6 紅曲菌的化學(xué)誘變

取稀釋到10-3～10-7濃度的MS-1原始孢子懸液0.2 mL于平板中，搖勻，倒入含有0.8‰LiCl的Lovastatin抗性培養(yǎng)基，制成含LiCl的Lovastatin抗性平板，每組三個平行，于30℃條件下避光培養(yǎng)4～5 d，挑取菌落生長速度較快的誘變菌落于試管培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)至茄子瓶擴培10 d。

1.3.7 紅曲菌的復(fù)合誘變

取稀釋到10-3～10-7冰浴后的誘變孢子懸液0.2 mL于平板中，搖勻，倒入含有0.8‰LiCl的Lovastatin抗性培養(yǎng)基，制成含LiCl的Lovastatin抗性平板，每組三個平行，于30℃條件下避光培養(yǎng)4～5 d。挑選菌落生長速度較快的誘變菌落于試管培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)至茄子瓶擴培10 d。

1.3.8 誘變紅曲菌的復(fù)篩

將上述三個初篩實驗中保留的16株誘變菌種繼續(xù)做優(yōu)化后培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵方法同1.3.2，14 d后檢測其產(chǎn)MPs和MK含量，與初篩時固態(tài)發(fā)酵相比較，復(fù)篩出產(chǎn)MPs或MK較高的誘變菌。

1.3.9 高產(chǎn)MK誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗及高產(chǎn)MPs誘變菌株的驗證

將復(fù)篩得到的高產(chǎn)MK的誘變菌株接種于茄子瓶斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)10 d，按照1.3.2的方法進行重復(fù)性固態(tài)發(fā)酵實驗，連續(xù)傳代5次，測定紅曲米中MK的含量，測定方法同1.3.4。此外在固態(tài)發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)兩株誘變菌在優(yōu)化后高產(chǎn)MK的配方（米粉∶豆粉=3∶2），培養(yǎng)方式為30℃條件下發(fā)酵3 d變溫至25℃培養(yǎng)至14 d固態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)生大量MPs。為驗證這一現(xiàn)象，將這兩株菌ZWS1和ZWS5與MS-1以純大米為基質(zhì)進行固態(tài)發(fā)酵，在30℃恒溫培養(yǎng)14d。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變的結(jié)果分析

2.1.1 15 cm 30 s紫外條件下誘變對紅曲菌產(chǎn)MPs和MK的影響

研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度的Lovastatin抗性平板下培養(yǎng)均長出大量誘變菌落，而在2.1 mg/mL條件下菌落相對較少，經(jīng)15 cm 30 s紫外誘變和2.1 mg/mL Lovastatin抗性平板下培養(yǎng)選育后，選出7株誘變菌，于固態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵14 d，以出發(fā)菌株MS-1產(chǎn)MPs和MK為對照組，其實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 15 cm 30 s紫外誘變條件下各菌株與對照菌株MS-1產(chǎn)紅曲色素色價（A）和莫納可林K含量（B）的比較Fig.1 Comparison of Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B) of different strains and control strain MS-1 at ultraviolet mutagenic condition of 15 cm 30 s

由圖1可知，在15 cm 30 s紫外誘變下，與出發(fā)菌株MS-1產(chǎn)MPs及MK含量相比，所有菌株均呈現(xiàn)正突變。其中菌株ZWT3、ZWT5、ZWT6的MPs和MK產(chǎn)量增加最為顯著。MPs產(chǎn)量分別增加了290.41%、293.50%和291.34%，MK產(chǎn)量分別增加了178.51%、175.25%和161.45%，故保留誘變菌株ZWT3、ZWT5、ZWT6這3株菌做復(fù)篩實驗。

2.1.2 15 cm 60 s紫外條件下誘變對紅曲菌產(chǎn)MPs和MK的影響

為提高突變率，將誘變時間提至60 s，經(jīng)質(zhì)量濃度2.1mg/mLLovastatin抗性平板培養(yǎng)選育后，選擇9株誘變菌在固態(tài)培養(yǎng)基上發(fā)酵14 d，以出發(fā)菌株MS-1為對照組，其產(chǎn)MPs和MK結(jié)果如圖2所示。

如圖2A所示，出發(fā)菌株經(jīng)過15 cm 60 s紫外照射誘變后，誘變菌株ZWS1和ZWS5的MPs產(chǎn)量較出發(fā)菌株MS-1提高，分別提高了398.69%、400.07%，菌株ZWS2降低了61.1%，其他菌株無明顯變化。如圖2B所示，與出發(fā)菌株MS-1相比，誘變菌株ZWS1和ZWS5固態(tài)發(fā)酵后MK產(chǎn)量提高，分別提高了34.07%、21.65%，菌株ZWS2、ZWS4、ZWS9的MK產(chǎn)量降低了23.51%、38.71%、30.72%，為負(fù)突變。綜合圖2A、B，選擇誘變菌株ZWS1、ZWS5這兩株菌做下一步復(fù)篩實驗。

圖2 15 cm 60 s紫外誘變條件下各菌株與對照菌株MS-1產(chǎn)紅曲色素色價（A）和莫納可林K含量（B）的比較Fig.2 Comparison of Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B) of different strains and control strain MS-1 at ultraviolet mutagenic condition of 15 cm 60 s

2.1.3 15 cm 90 s紫外條件下誘變對紅曲菌產(chǎn)MPs和MK的影響

圖3 15 cm 90 s紫外誘變條件下各菌株與對照菌株MS-1產(chǎn)紅曲色素色價（A）和莫納可林K含量（B）的比較Fig.3 Comparison of Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B) of different strains and control strain MS-1 at ultraviolet mutagenic condition of 15 cm 90 s

為提高誘變效果，將誘變時間提至90 s，經(jīng)質(zhì)量濃度2.1 mg/mL Lovastatin抗性平板下培養(yǎng)選育后，選擇3株誘變菌在固態(tài)培養(yǎng)基上發(fā)酵14d，以出發(fā)菌株MS-1為對照組，其MPs和MK產(chǎn)量結(jié)果如圖3所示。

如圖3A所示，經(jīng)15 cm 90 s紫外照射誘變篩選出的誘變紅曲菌與出發(fā)菌株MS-1相比，誘變菌株ZWN1、ZWN2產(chǎn)MPs能力分別提高了129.65%和74.87%。如圖3B所示，ZWN1產(chǎn)MK能力提高了40.93%。結(jié)合圖3A、圖3B，保留菌株ZWN1和ZWN2做復(fù)篩實驗。

2.2 氯化鋰化學(xué)誘變對紅曲菌產(chǎn)MPs和MK的影響

由于誘變的不定向性，為提高突變率，采用0.8‰氯化鋰化學(xué)誘變對原始菌株MS-1進行處理，所得菌株通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK情況如圖4所示。

圖4 LiCl化學(xué)誘變條件下各菌株與對照菌株MS-1產(chǎn)紅曲色素色價（A）和莫納可林K含量（B）的比較Fig.4 Comparison of Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B) of different strains at the condition of LiCl chemical mutagenesis

如圖4A所示，與出發(fā)菌株MS-1相比，誘變菌株LHL1、LHL2產(chǎn)MPs能力分別提高了122.11%和94.72%，如圖4B所示，菌株LHL1、LHL2產(chǎn)MK能力分別提高了71.21%和48.63%。結(jié)合圖4A、圖4B，保留菌株LHL1、LHL2做復(fù)篩實驗。

2.3 紫外-氯化鋰復(fù)合誘變對紅曲菌產(chǎn)MPs和MK的影響

為提高突變的多樣性，采用0.8‰氯化鋰及15 cm 90 s紫外的復(fù)合誘變對原始菌株MS-1進行處理，所得菌株通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK情況如圖5所示。

如圖5A所示，與出發(fā)菌株MS-1相比，誘變菌株FH3、FH5產(chǎn)MPs能力分別提高了76.76%和145.23%。如圖5B所示，菌株FH2、FH5產(chǎn)MK能力分別提高了35.74%和38.95%。結(jié)合圖5A、圖5B，保留FH2、FH3、FH5這3株菌做復(fù)篩實驗。

圖5 復(fù)合誘變條件下各菌株與對照組MS-1產(chǎn)紅曲色素色價（A）和莫納可林K含量（B）的比較Fig.5 Comparison of Monascus pigment value(A)monacolin K content(B) of different strains at the condition of complex mutagenesis

2.4 誘變菌株的復(fù)篩

圖6 初篩和復(fù)篩后各菌株產(chǎn)紅曲色素色價（A）和莫納可林K含量（B）的比較Fig.6 Comparison of the Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B)in different strains of screening and secondary screening

將上述五個初篩實驗中保留的12株誘變菌種繼續(xù)做固態(tài)發(fā)酵，方法同1.3.2，14 d后檢測其MPs和MK產(chǎn)量，與初次獲得誘變菌時MPs和MK產(chǎn)量進行對比，結(jié)果如圖6所示。

由圖6A可知，復(fù)篩后的誘變菌產(chǎn)MPs與初篩時相比，產(chǎn)量較高且較穩(wěn)定的菌株有菌株ZWS1和ZWS5，由圖6B可知，產(chǎn)MK含量較高且較穩(wěn)定的菌株有菌株ZWN2、LHL1、FH2和FH3這4株菌。故保留這6株菌做遺傳穩(wěn)定性和驗證實驗。

2.5 高產(chǎn)MK誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗及高產(chǎn)MPs誘變菌株的驗證

將復(fù)篩得到的5株高產(chǎn)MK的誘變菌株接種于茄子瓶斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)10d，按照1.3.2的方法進行重復(fù)性固態(tài)發(fā)酵實驗，連續(xù)傳代5次，測定紅曲米中MK的含量，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，菌株LHL1、ZWN2和FH2這三株誘變菌株產(chǎn)MK的能力每一代都相差不大，遺傳穩(wěn)定性較好，而誘變菌株FH3產(chǎn)MK能力不穩(wěn)定，因此選擇菌株LHL1、ZWN2和FH2這三株高產(chǎn)MK的誘變菌繼續(xù)做研究。

表1 誘變紅曲菌的遺傳穩(wěn)定性Table 1 Genetic stability of mutant Monascus strains

在固態(tài)發(fā)酵過程中，使用的配方是優(yōu)化后高產(chǎn)MK的配方（米粉∶豆粉=3∶2）變溫培養(yǎng)，但發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，兩株誘變菌ZWS1和ZWS5在高產(chǎn)MK固態(tài)培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量MPs。為驗證這一現(xiàn)象，考慮到添加豆粉主要是促進MK的產(chǎn)生[17]，在優(yōu)化后配方中主要對MPs產(chǎn)生呈抑制作用。故將上述兩株菌ZWS1和ZWS5與MS-1以純大米為基質(zhì)進行固態(tài)發(fā)酵，在30℃恒溫培養(yǎng)14 d，檢測其產(chǎn)MPs結(jié)果如圖7所示。

圖7 高產(chǎn)MPs誘變菌恒溫條件下產(chǎn)紅曲色素情況Fig.7 Production of MPs of mutagenic strains with high yield Monascus pigments at constant temperature condition

如圖7所示，菌株ZWS1產(chǎn)MPs能力較出發(fā)菌株MS-1有所下降，與之前結(jié)論相悖。說明該菌株在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)MPs的能力相差較大，可在后續(xù)研究中進一步確定其產(chǎn)MPs的能力及最適培養(yǎng)條件。ZWS5菌株與出發(fā)菌株MS-1相比，產(chǎn)MPs能力提高了23.36%，具有后續(xù)研究的意義。

3 結(jié)論

對高產(chǎn)MPs和MK，不產(chǎn)桔霉素的原始菌株MS-1進行一系列單因素誘變和復(fù)合誘變初篩以及固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性實驗，分別得到1株高產(chǎn)紅曲MPs的誘變菌ZWS5和3株高產(chǎn)MK且遺傳穩(wěn)定性良好的誘變菌ZWN2、LHL1和FH2，其中菌株ZWS5產(chǎn)MPs總色價為1 476.25 U/g，與出發(fā)菌株MS-1相比產(chǎn)MPs能力提高了23.36%；菌株ZWN2、LHL1和FH2的MK產(chǎn)量分別為7.34 mg/g、7.03 mg/g、和7.16 mg/g，比原始菌株MS-1產(chǎn)MK能力（5.75 mg/g）（第五代遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果）分別提高了27.65%、22.26%和24.52%。