金櫻子HPLC指紋圖譜研究

胡瑩 吳啟南

摘要：目的 建立金櫻子指紋圖譜，為提高金櫻子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，為規(guī)范金櫻子飲片市場(chǎng)及確保藥材內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性提供較全面的質(zhì)量控制手段。方法 采用HPLC結(jié)合《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)金櫻子指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)并建立共有模式，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果 初步建立了金櫻子HPLC指紋圖譜，確定了10個(gè)不同產(chǎn)地金櫻子指紋圖譜的9個(gè)共有峰。結(jié)論 本方法建立的HPLC指紋圖譜可用于金櫻子質(zhì)量評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：金櫻子；蘆丁；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.018

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）12-0071-05

Abstract： Objective To establish the fingerprint of Rosae Laevigatae Fructus； To lay a foundation for improving the quality standard of Rosae Laevigatae Fructus； To provide a comprehensive quality control method for the market standardization of Rosae Laevigatae Fructus sample to ensure the quality of medicinal materials internal homogeneity and stability. Methods HPLC method and TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition） were used to evaluate the similarity and establish the common mode of Rosae Laevigatae Fructus， and the SPSS19.0 software was used for cluster analysis. Results The HPLC fingerprint of Rosae Laevigatae Fructus was established， and a total of 9 common peaks of Rosae Laevigatae Fructus from 10 different producing areas were marked. Conclusion The HPLC fingerprint established in this study can be used for the quality evaluation of Rosae Laevigatae Fructus.

Keywords： Rosae Laevigatae Fructus； rutin； HPLC； fingerprints； cluster analysis

金櫻子Rosa Laevigata Michx.系薔薇科薔薇屬植物，果實(shí)入藥名金櫻子?，F(xiàn)代研究表明，金櫻子對(duì)燒燙傷、皮膚腫瘤、神經(jīng)性頭痛、神經(jīng)衰弱都具有很好的療效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，金櫻子具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2-3]、抗病毒、降血糖、降血脂等作用[4]。文獻(xiàn)報(bào)道，金櫻子果實(shí)主要含三萜類、黃酮類及多糖類等活性物質(zhì)化學(xué)成分[5-6]。其他營(yíng)養(yǎng)成分還包括維生素C、B1、B2及胡蘿卜素等多種維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸和氨基酸。金櫻子含有的蘆丁具有維生素P類作用，能夠降低毛細(xì)血管通透性和脆性，維持血管正常彈性，具有抗炎、抗病毒作用。本研究選擇蘆丁作為指標(biāo)成分，測(cè)定其含量，建立金櫻子HPLC指紋圖譜，用于10個(gè)不同產(chǎn)地金櫻子的模式識(shí)別研究，通過(guò)選擇保留時(shí)間、峰高、峰面積等作為數(shù)字特征，確立其共有模式，為提高金櫻子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，并為規(guī)范金櫻子飲片市場(chǎng)及確保藥材內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性提供較全面的質(zhì)量控制手段。

1 儀器與試藥

美國(guó)安捷倫1260高效液相色譜儀（美國(guó)惠普公司），包括DEABL00204低壓四元泵、DEAAK03494柱溫箱、DEAAN00315自動(dòng)進(jìn)樣器、DEAAX00613紫外檢測(cè)器；BP112型電子天平（德國(guó)Satorius公司）；Milli-Q GradientA10超純水器（Millipore Inc. USA）

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)110831-201204）、金櫻子對(duì)照藥材（批號(hào)121047-201204），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（Tedia美國(guó)，色譜純），甲醇（上?；瘜W(xué)試劑有限公司），醋酸（上?；瘜W(xué)試劑有限公司），雙蒸水為本實(shí)驗(yàn)室制備并經(jīng)過(guò)0.45 ?m濾膜過(guò)濾。金櫻子樣品來(lái)源于10個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為薔薇科植物金櫻子Rosa Laevigata Michx.的干燥成熟果實(shí)，來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用安捷倫Hedera ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%醋酸水（B），梯度洗脫（見(jiàn)表2），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 ?L，分離時(shí)間60 min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定蘆丁對(duì)照品0.05 g，置于50 mL棕色量瓶中，以甲醇溶解，超聲10 min并定容至刻度，即得蘆丁對(duì)照品溶液，置于冰箱4 ℃冷藏，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取金櫻子樣品粉末（過(guò)60目篩）10 g，精密加70%甲醇100 mL于250 mL具塞錐形瓶中，水?。?0 ℃）回流提取1 h，過(guò)濾，藥渣及濾紙同置于錐形瓶中，加70%甲醇100 mL，水?。?0 ℃）回流提取1 h，過(guò)濾，用70%甲醇洗滌藥渣及濾紙，合并濾液和洗液，置于蒸發(fā)皿中揮去部分溶劑，加70%甲醇定容至5 mL量瓶中，0.45 ?m微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 空白試驗(yàn)

精密吸取空白溶液（甲醇）10 ?L，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行洗脫，結(jié)果溶劑在前5 min出峰完畢，即空白不干擾測(cè)定。

2.4.2 分析時(shí)間確定

取供試品溶液進(jìn)樣，在60 min后已無(wú)大量成分殘留，確定金櫻子指紋圖譜的分析時(shí)間為60 min。

2.4.3 精密度試驗(yàn)

取同一批金櫻子樣品（S10）溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算色譜峰相似度。結(jié)果9個(gè)共有峰相似度>0.95，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批金櫻子樣品（S10）溶液，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算色譜峰相似度。結(jié)果9個(gè)共有峰相似度>0.95，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批金櫻子樣品（S10）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定，計(jì)算色譜峰相似度。結(jié)果9個(gè)共有峰相似度>0.95，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 樣品測(cè)定

精密吸取按“2.3”項(xiàng)下方法制備的10個(gè)不同產(chǎn)地金櫻子供試品溶液和金櫻子對(duì)照藥材溶液各10 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 共有峰的確定

10個(gè)產(chǎn)地金櫻子HPLC色譜圖測(cè)定結(jié)果顯示，主要有9個(gè)共有峰。選擇5號(hào)峰作為參照峰，得到10個(gè)產(chǎn)地金櫻子和金櫻子對(duì)照藥材9個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。除5號(hào)峰外，其他8個(gè)峰相對(duì)保留時(shí)間依次為0.57、0.93、0.95、0.97、1.02、1.03、1.10、1.29，各共有峰相對(duì)較穩(wěn)定，具有指紋圖譜特征性。經(jīng)與對(duì)照品圖譜（見(jiàn)圖1）比對(duì)，確定5號(hào)峰為蘆丁色譜峰，其峰面積超過(guò)總峰面積的20%，為第一大峰，范圍在28.844%～54.995%之間。

2.6.2 共有模式的建立與相似度分析

采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)并建立共有模式。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件，通過(guò)選峰設(shè)定匹配模板，將導(dǎo)入的色譜峰自動(dòng)匹配，建立共有模式（見(jiàn)圖2）及指紋圖譜疊加圖（見(jiàn)圖3），進(jìn)行譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體性評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。分別以指紋圖譜共有模式和金櫻子對(duì)照藥材為對(duì)照，計(jì)算10個(gè)產(chǎn)地金櫻子樣品指紋圖譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表4。

分析可知，S1（湖北宜昌）、S4（貴州畢節(jié)）、S7（四川大巴山）相似度較差，S3（湖南懷化）與對(duì)照藥材最為接近。雖然各產(chǎn)地金櫻子樣品保留時(shí)間并沒(méi)有出現(xiàn)較為明顯的差異，但各共有峰的峰面積卻存在差異。由于本研究收集的金櫻子樣品都是在同年10～11月果實(shí)成熟期采收的，所以其差異可能是由產(chǎn)地氣候、土壤、光照、水分等因素導(dǎo)致的。具體原因需要根據(jù)采收地的天氣情況、土壤成分分析、水分分析等進(jìn)一步研究。

2.6.3 聚類分析

運(yùn)用SPSS19.0軟件對(duì)10個(gè)產(chǎn)地金櫻子樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，以?shī)A角余弦作為樣品相似度的距離公式，利用組間連結(jié)方法，得到聚類分析結(jié)果（見(jiàn)圖4）。通過(guò)聚類分析將金櫻子樣品分為質(zhì)量好的Ⅰ類（S6、S8、S9、S5）、質(zhì)量較好的Ⅱ類（S2、S3、S10）、質(zhì)量較差的Ⅲ類（S4、S7）和質(zhì)量最差的Ⅳ類（S1）。Ⅰ類和Ⅱ類的夾角余弦均在0.9以上，而質(zhì)量最差的Ⅳ類夾角余弦只有0.32，與其他3類樣品相差較大。

將《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》評(píng)價(jià)結(jié)果與利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件聚類分析結(jié)果進(jìn)行比較，二者較為一致，可相互驗(yàn)證。根據(jù)2種分析方法的計(jì)算結(jié)果，相似度>0.9的樣品（S6、S8、S9、S5）為金櫻子的推薦品，質(zhì)量較好；相似度<0.9的樣品為非推薦品，質(zhì)量較差，以S1最差。

2.7 蘆丁含量測(cè)定

2.7.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取0.05 ?g/mL蘆丁對(duì)照品溶液10 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積RSD<5%，表明精密度良好。

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取0.05 ?g/mL蘆丁對(duì)照品溶液10 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果峰面積RSD<5%，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批金櫻子樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果峰面積RSD<5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.4 線性關(guān)系考察

分別吸取不同濃度蘆丁對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=2538.0X+59.873，r?=0.999 1。結(jié)果表明，在0.02～1 ?g范圍內(nèi)，蘆丁進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的金櫻子樣品（S7）2 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分成6份，分別加入一定濃度的蘆丁對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.7.6 樣品含量測(cè)定

取10個(gè)不同產(chǎn)地的金櫻子樣品和金櫻子對(duì)照藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。S2（廣西桂林）、S5（江西撫州）含量較高。

3 討論

本試驗(yàn)首先對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇和乙醇回流提取，以及超聲與回流提取的效果，結(jié)果70%甲醇回流提取2 h得到的色譜峰信息最佳。金櫻子中各類成分在260、273、370 nm波長(zhǎng)附近均有較大吸收，但在370 nm處的特征峰相對(duì)較多且峰值最大，基線也較為平穩(wěn)，故選擇370 nm作為金櫻子指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。本試驗(yàn)分別以乙腈- 0.5%醋酸水溶液、甲醇-0.5%醋酸水溶液、乙腈-0.5%甲酸水溶液、甲醇-0.5%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果乙腈-0.5%醋酸水溶液系統(tǒng)的洗脫效果在分離度及峰型上都最佳，出峰數(shù)也最多。同時(shí)，將分離時(shí)間加長(zhǎng)至2倍，結(jié)果色譜圖顯示60 min后無(wú)其他色譜峰出現(xiàn)，從而確定梯度洗脫時(shí)間為60 min。

金櫻子化學(xué)成分種類多且復(fù)雜，僅測(cè)定單一或多個(gè)有效成分的含量無(wú)法全面反映其質(zhì)量，因此，建立系統(tǒng)、全面、完整的特征指紋圖譜對(duì)金櫻子藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)十分必要。本試驗(yàn)建立金櫻子HPLC指紋圖譜，確定了10個(gè)不同產(chǎn)地金櫻子的9個(gè)共有峰。以各產(chǎn)地間峰面積相對(duì)百分含量初步擬定特征指紋峰，以5、7、9號(hào)峰為強(qiáng)峰。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度分析系統(tǒng)（2012版）》對(duì)10個(gè)產(chǎn)地金櫻子進(jìn)行比對(duì)，得出結(jié)果：若以共有模式作為對(duì)照，各產(chǎn)地樣品的相似度在0.246～0.984之間；若以金櫻子對(duì)照藥材為對(duì)照，相似度在0.271～0.979之間。10個(gè)不同產(chǎn)地的金櫻子樣品存在較大差異，尤以S1（湖北宜昌）、S4（貴州畢節(jié)）、S7（四川大巴山）差異最為明顯。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，得出5號(hào)共有峰為蘆丁。通過(guò)含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地樣品蘆丁含量存在明顯差異。今后將對(duì)其他共有特征峰的鑒別、其他主要成分在樣品中的含量的差異性進(jìn)一步進(jìn)行研究。

通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》和SPSS19.0聚類分析進(jìn)行相互驗(yàn)證，得出相同結(jié)論。不同產(chǎn)地金櫻子樣品雖然采收季節(jié)相同，其主要色譜峰大體一致，但由于不同的地理環(huán)境、土壤、氣候等影響，可能存在一些差異，表現(xiàn)為同一色譜條件下色譜圖上峰位差異，不同產(chǎn)地金櫻子的質(zhì)量也存在差異，表現(xiàn)在同一保留時(shí)間具有不同的峰面積。我們通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用分析手段進(jìn)一步確定各主成分含量的差異性，結(jié)果表明與含量測(cè)定結(jié)果基本一致，S1、S4質(zhì)量較優(yōu)。本試驗(yàn)建立的金櫻子HPLC指紋圖譜為金櫻子的質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

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