生/制何首烏HPLC指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別與含量測(cè)定的質(zhì)量控制研究

林艷 劉月新 李春 肖榕 吳萍 張智敏 林麗美 廖端芳

摘要：目的 建立不同產(chǎn)地生/制何首烏的指紋圖譜，結(jié)合模式識(shí)別與含量測(cè)定對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和鑒別。方法 采用HPLC對(duì)20批生/制何首烏進(jìn)行檢測(cè)，建立何首烏HPLC指紋圖譜，運(yùn)用相似度分析、主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，尋找生/制何首烏分類的主要貢獻(xiàn)峰，并對(duì)主要差異性化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果 建立了生/制何首烏的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了10個(gè)共有峰，其中4個(gè)峰分別被指認(rèn)為沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚，相似度在0.863～0.991之間；通過(guò)主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析基本能區(qū)分生、制何首烏，并確定二苯乙烯苷和大黃素為生、制何首烏的主要差異性化學(xué)成分；生、制何首烏中二苯乙烯苷的含量分別為19.30～37.72 mg/g、7.50～18.26 mg/g，大黃素的含量分別為0.53～1.67 mg/g、0.11～0.50 mg/g。結(jié)論 指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別與含量測(cè)定不僅可以實(shí)現(xiàn)何首烏質(zhì)量整體信息的控制，而且能有效區(qū)分生、制何首烏。

關(guān)鍵詞：何首烏；指紋圖譜；二苯乙烯苷；大黃素；模式識(shí)別

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.016

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）12-0062-05

Abstract： Objective To establish fingerprints of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. from different producing areas； To identify and evaluate its quality by combining with pattern recognition and content determination. Methods HPLC was used to detect 20 batches of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and HPLC fingerprints of Polygonum multiflorum Thunb. were established. Similarity analysis， principal component analysis and orthogonal partial least squares-discrimination analysis were used to evaluate and find the main contribution peaks leading to the classification of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and content determination of main different chemical components was conducted. Results HPLC fingerprints of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. were established， and 10 common peaks were marked， 4 of which were referred to as gallic acid， stilbene， emodin and emodin methyl ether， respectively， with similarities between 0.863 and 0.991. Principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis could basically separate crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and stilbene and emodin were determined as the main different chemical components between crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.. The contents of stilbene in crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. were 19.30–37.72 mg/g and 7.50–18.26 mg/g， respectively， and the contents of emodin were 0.53–1.67 mg/g and 0.11–0.50 mg/g， respectively. Conclusion Fingerprints combined with pattern recognition and content determination can not only realize the control of quality overall information of Polygonum multiflorum Thunb.， but also effectively separate crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.

Keywords： Polygonum multiflorum Thunb.； fingerprints； stilbene； emodin； pattern recognition

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根。生何首烏苦泄性平兼發(fā)散，具有解毒消癰、潤(rùn)腸通便、截瘧功效；制何首烏味甘厚性溫，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨的作用[1]?，F(xiàn)代研究表明，何首烏中主要含有二苯乙烯苷、蒽醌及鞣質(zhì)等活性成分[2-3]。何首烏受產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收時(shí)間、炮制加工、貯存等因素影響，其化學(xué)成分及質(zhì)量存在一定的差異。

指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別方法已被應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制、差異標(biāo)記物的篩選等方面[4-5]。何首烏藥材指紋圖譜目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，但僅涉及建立HPLC指紋圖譜，或分析二苯乙烯苷含量與生/制何首烏分類及質(zhì)量控制的關(guān)系[6-12]。因此，本研究建立生/制何首烏指紋圖譜并對(duì)其進(jìn)行模式識(shí)別，尋找導(dǎo)致生/制何首烏差別的主要貢獻(xiàn)化合物，并對(duì)主要差異性化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定，為何首烏質(zhì)量整體控制及生/制何首烏的鑒別提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)（PDA檢測(cè)器），安捷倫科技有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；CP114電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；0.22 ?m微孔濾膜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；RT-04A型高速粉碎機(jī)，香港泓荃制藥機(jī)械公司。

沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)YA0505YA14，純度≥98%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)P02N6F299，純度≥98%）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)P21S6F3673，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；二苯乙烯苷對(duì)照品（批號(hào)N1103AS，純度≥98%），大連美侖生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。20批何首烏飲片購(gòu)于其產(chǎn)地各省大藥房和市場(chǎng)，所有樣品均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室龔力民副教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Epic-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：甲醇（B）-水溶液（D），梯度洗脫（0～12 min，10%～40%B；12～20 min，40%～60%B；20～27min，60%～90%B；27～30min，90%～100%B；30～40min，100%B）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 4種化學(xué)成分對(duì)照品溶液的制備

分別取沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚濃度分別為0.34、3.68、0.36、0.91 mg/mL混合對(duì)照品溶液，用于指紋色譜峰確認(rèn)。

2.2.2 2種化學(xué)成分對(duì)照品溶液的制備

分別取二苯乙烯苷、大黃素對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得對(duì)照品貯備液；取一定量對(duì)照品貯備液，用甲醇逐級(jí)稀釋，得到二苯乙烯苷濃度分別為0.046、0.092、0.184、0.368、0.736、1.472 g/L，大黃素濃度分別為0.001 8、0.003 6、0.007 2、0.014 4、0.028 8、0.057 6 g/L的混合對(duì)照品溶液，用于含量測(cè)定。

2.2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入60%甲醇，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 ?m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一批樣品粉末（S9），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以第1次進(jìn)樣所得指紋圖譜作為對(duì)照?qǐng)D譜計(jì)算相似度，其相似度均大于0.99，表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品粉末（S9），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以0 h所得指紋圖譜為對(duì)照，各指紋圖譜相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品粉末（S9），按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定，其指紋圖譜相似度均大于0.97，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及分析

按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備20批何首烏供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采集40 min色譜圖，剔除因流動(dòng)相梯度變化而出現(xiàn)的不規(guī)則色譜峰，選擇峰面積最大、出峰時(shí)間最穩(wěn)定的5號(hào)峰為作為參照峰，分別計(jì)算其他共有峰相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2010版）》進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生成何首烏指紋圖譜。根據(jù)20批樣品測(cè)定結(jié)果，標(biāo)定了10個(gè)共有峰，指認(rèn)了3、5、9、10號(hào)4個(gè)色譜峰，分別為沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚。結(jié)果見圖1。

2.3.5 何首烏相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2010版）》對(duì)20批何首烏指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果20批樣品的相似度分別為0.884、0.996、0.975、0.984、0.990、0.970、0.982、0.970、0.985、0.986、0.971、0.983、0.988、0.985、0.957、0.976、0.983、0.863、0.962、0.991，均大于0.85，具有良好的相似度，表明不同批次的何首烏化學(xué)成分組成基本一致，質(zhì)量穩(wěn)定。但不同批次各色譜峰的峰面積存在差異，說(shuō)明各化學(xué)成分含量具有一定的差異。

2.4 化學(xué)模式識(shí)別

2.4.1 主成分分析

采用主成分分析（PCA）對(duì)20批何首烏樣品建模，以共有峰峰面積為自變量（以出峰時(shí)間標(biāo)記峰的歸屬），以不同批次何首烏為因變量（Y），將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca13.0軟件進(jìn)行分析，從PCA得分圖可見，20批何首烏大致可分為2類，見圖2。

2.4.2 正交偏最小二乘法-判別分析

運(yùn)用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）建立生/制何首烏HPLC指紋圖譜差異模型。結(jié)果表明，該方法能夠很好地將生/制何首烏分成2類，見圖3。根據(jù)VIP>1.5、P<0.05的變量來(lái)篩選導(dǎo)致差異性的主要化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)5號(hào)峰二苯乙烯苷（Rt=19.228）和9號(hào)峰大黃素（Rt=33.018）為生/制何首烏最主要的差異性化學(xué)成分，見圖4。

2.5 特征成分含量測(cè)定

2.5.1 線性關(guān)系考察

取一定量對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算。結(jié)果二苯乙烯苷回歸方程為Y=3083.2X-34.1，r=0.999 0，在0.23～7.36 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃素回歸方程為Y=17 103X-12.46，r=0.999 2，在0.009～0.288 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批樣品粉末（S9）6份，每份0.15 g，精密稱定，按相當(dāng)于樣品中二苯乙烯苷、大黃素測(cè)定量100%加入相應(yīng)對(duì)照品，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.5.3 樣品含量測(cè)定

分別取20批何首烏樣品粉末，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算樣品中二苯乙烯苷和大黃素含量，結(jié)果見圖5、圖6。20批樣品中，二苯乙烯苷在生何首烏中含量為19.30～37.72 mg/g（1.9%～3.8%），在制何首烏中含量為7.50～18.26 mg/g（0.7%～1.8%）。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，二苯乙烯苷在生何首烏中含量不得低于1.0%，在制何首烏中含量不得低于0.7%。據(jù)此判斷，20批樣品均為合格品，與指紋圖譜相似度分析結(jié)果一致。此外，由于生何首烏中二苯乙烯苷的含量在1.9%以上，而制何首烏中二苯乙烯苷的含量在1.9%以下，據(jù)此可以區(qū)分生、制何首烏。20批樣品中，大黃素在生何首烏中含量為0.53～1.67 mg/g（0.05%～0.17%），在制何首烏中含量為0.11～0.50 mg/g（0.01%～0.05%），可見，生何首烏中大黃素含量在0.05%以上，制何首烏中大黃素含量在0.05%以下，據(jù)此也可區(qū)分生、制何首烏。上述二苯乙烯苷和大黃素含量測(cè)定結(jié)果與指紋圖譜模式識(shí)別結(jié)果一致，兩者可相互驗(yàn)證。

圖5 20批何首烏中二苯乙烯苷和大黃素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)樣品提取方法（超聲、回流）、提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇）、提取時(shí)間（15、30、45 min）、流動(dòng)相（甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.05%甲酸）、波長(zhǎng)（280、235、264 nm）、色譜柱（Agilent Zorbax Sb-C18，Agilent Eclipse Xdb-C18，Epic-C18）進(jìn)行了詳細(xì)考察，確定了樣品處理方法和色譜條件，在此條件下色譜峰較多，分離效果較好。

本試驗(yàn)建立了生/制何首烏HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了10個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中4個(gè)色譜峰。通過(guò)模式識(shí)別分析方法，建立了生/制何首烏的分類模型，并確定二苯乙烯苷和大黃素是生/制何首烏中最主要的差異性化學(xué)成分。另外，也可根據(jù)何首烏中二苯乙烯苷和大黃素的含量測(cè)定結(jié)果區(qū)分生/制何首烏。本試驗(yàn)建立的指紋圖譜和含量測(cè)定方法，不僅能體現(xiàn)何首烏的整體質(zhì)量，也可有效區(qū)分生、制何首烏，為何首烏的質(zhì)量控制提供參考。

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