半夏瀉心湯對(duì)肝郁模型大鼠cAMP、PKA水平以及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

潘嘉，寧楠，黃利，劉潔，劉亞歐，鄧延莉，于婭，李利民

抑郁癥(depression)是一種常見的情緒障礙綜合征，由與潛在的生物學(xué)異常有關(guān)的癥狀和體征組成，以心境低落為主要特征。世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球約有抑郁癥患者3.4億，抑郁癥終生患病率高達(dá)6.1%～9.5%。抑郁癥所致傷殘居各類疾病之首，嚴(yán)重危害人類身心健康，給社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)。所以，本病具有高患病、高復(fù)發(fā)、高致殘、高醫(yī)療成本的特點(diǎn)[1]。

抑郁癥屬于中醫(yī)的“郁癥”范疇，與肝臟密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，肝為剛臟，喜條達(dá)，惡抑郁，主疏泄。肝主疏泄功能失調(diào)日久則化為肝郁。肝郁一般由精神情志刺激引發(fā)，而精神情志發(fā)于腦，情志的調(diào)節(jié)多與腦內(nèi)的去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羥色胺（5-HT）等密切相關(guān)。在我們過去的研究中發(fā)現(xiàn)：半夏瀉心湯對(duì)脾虛大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有調(diào)節(jié)作用[2]。由此設(shè)想半夏瀉心湯對(duì)肝郁可能具有一定影響，為驗(yàn)證上述設(shè)想，我們進(jìn)行了半夏瀉心湯對(duì)肝郁模型大鼠的影響實(shí)驗(yàn)，以探討半夏瀉心湯對(duì)肝郁模型大鼠的影響。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物

半夏瀉心湯各組成藥物均購自四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，其中炙甘草產(chǎn)于新疆，黃芩產(chǎn)于河北，人參產(chǎn)于東北，干姜產(chǎn)于四川，黃連產(chǎn)于四川，法半夏產(chǎn)于四川，以上藥物均執(zhí)行2010年國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，大棗產(chǎn)于新疆（自配）。按照生藥劑量比例根據(jù)文獻(xiàn)折算給藥量，依照人單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量，并擴(kuò)大5倍。全方由半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，甘草9 g，大棗4枚組成，精確稱取上述相應(yīng)劑量的生藥，加入10倍量清水浸泡30 min（人參提前浸泡24 h），常規(guī)煎煮2次，30 min/次，100目濾布過濾藥液，2次濾液混合后，60℃水浴加熱濃縮為每1 mL藥液含1g生藥的提取藥液供給藥用。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，60只，全雌，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2013-19號(hào)，所有動(dòng)物于室溫18～22℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h明暗交替環(huán)境中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)一周后實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑

Rat Dopamine (DA) ELISA Kit，Rat Noradrenaline(NE) ELISA Kit;，Rat 5-hydroxy tryptamine (5-HT)ELISA Kit均為USA MyBioSource, Inc出品；大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP） ELISA試劑盒，大鼠蛋白激酶A（PKA） ELISA試劑盒，由上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)；TotalRNAExtractor(Trizol), 100 mL/瓶，Lot:B921KAC166,有效期至：03/2017，生工生物工程（上海）股份有限公司；RevertAid First Satrand cDNA Synthesis Kit, Lot 00221108, Exp.07.2016,Thermo Scientific；SsoFastTM EvaGreen? supermix,Control 760000152,Exp 2016-12-14, BioRad；抗大鼠抗體腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子( brain derived neurotrophic factor，BDNF)，抗大鼠抗體DA受體（多巴胺受體），多聚體抗兔IgG-HRP，DAB顯色試劑盒等，均由武漢博士德生物工程有限公司出品；鹽酸氟西汀片（常州四藥制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20130701）。

1.4 儀器

Discovry XT全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)，Roche；酶標(biāo)儀，洗板機(jī)，Denly Dragon；光譜掃描式多功能讀數(shù)儀，Thermo Fisher；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，BioRad CFX96；

2 方法

2.1 造摸及給藥

SD大鼠隨機(jī)分成6組：正常組、模型組、半夏瀉心湯 (5，2.5，1.25 g·kg-1) 給藥組，陽性對(duì)照鹽酸氟西汀(4 mg·kg-1)組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠在頸部帶上自制鐵圈，鐵圈寬度為12毫米。連續(xù)佩戴6周。6周后開始給藥，正常組和模型組每天灌胃等體積的蒸餾水，陽性藥組灌胃4 mg·kg-1的鹽酸氟西汀，給藥組分別按劑量灌胃半夏瀉心湯。每天定時(shí)灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。實(shí)驗(yàn)過程中每周稱重一次，并根據(jù)最新體重調(diào)整給藥體積。

2.2 糖水消耗實(shí)驗(yàn)[4]

分別于造模前、造模6周、給藥2周和給藥4周時(shí)進(jìn)行4次糖水消耗量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)時(shí)在安靜的房間內(nèi)訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)喝糖水，第1天每籠放置2瓶糖水(1%蔗糖溶液)；第2天1瓶糖水，1瓶純水，2瓶位置隨機(jī)；第3天禁食禁水，第4天給每只大鼠隨機(jī)放置2個(gè)水瓶，分別放置計(jì)量稱重的1%蔗糖水和純水，24小時(shí)后取2瓶水再次稱重。記錄每只大鼠的糖水和純水的消耗量，計(jì)算糖水偏嗜度。

2.3 大鼠血清和腦組織海馬區(qū)cAMP和PKA活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，參照文獻(xiàn)[7]方法，麻醉動(dòng)物腹主動(dòng)脈取血后放血處死，迅速取腦，置冰盒上，取出大腦，分離左側(cè)海馬和皮層組織，分別稱重，按重量和體積比1∶10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿。血液靜置半小時(shí)后，和組織勻漿均在4℃，3500 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，參照試劑盒說明書立即測(cè)定cAMP和PKA活性。

2.4 大鼠海馬DA、NE和5-HT含量的測(cè)定

取上述方法制備的海馬區(qū)組織勻漿，按試劑盒說明書檢測(cè)方法采用Elisa法檢測(cè)DA、NE和5-HT含量。

2.5 大鼠額葉皮層DA和BDNF的含量檢測(cè)

學(xué)習(xí)記憶測(cè)試結(jié)束后1h，動(dòng)物腹主動(dòng)脈取血后放血處死，迅速取腦，置于冰盒上，取出大腦，分離大鼠額葉皮層，迅速放入4%多聚甲醛固定液中，2天后常規(guī)石蠟包埋、切片、Roche全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)染色。應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)獲得高清晰的免疫組化染色病理圖片（100倍）。使用Image Pro Plus7.0分析測(cè)量大鼠額葉皮層DA和BDNF的表達(dá)面積和累積光密度，用非參數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 半夏瀉心湯對(duì)肝郁大鼠糖水偏嗜度的影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模后，模型組大鼠蔗糖水的消耗量逐漸減少，對(duì)糖水偏嗜程度明顯下降。半夏瀉心湯給藥4周后，半夏瀉心湯給藥組大鼠蔗糖水的消耗量逐漸增加，提示半夏瀉心湯可明顯提高大鼠對(duì)糖水的偏愛程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體見表1。

表1 半夏瀉心湯對(duì)肝郁大鼠糖水偏愛百分比的影響(%，n=10)

3.2 半夏瀉心湯對(duì)海馬和血清cAMP和PKA的影響

與對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物海馬區(qū)組織cAMP和PKA水平明顯降低，而血清cAMP和PKA含量沒有明顯改變。與模型組比較，半夏瀉心湯給藥后，各給藥組可明顯提高海馬區(qū)組織cAMP和PKA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體見表2。

表2 半夏瀉心湯對(duì)海馬區(qū)和血清cAMP和PKA水平的影響

3.3 半夏瀉心湯對(duì)海馬區(qū)5-HT、DA和NA含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物海馬區(qū)組織5-HT和DA含量明顯降低（P＜0.01），模型組大鼠海馬組織NA含量與對(duì)照組基本一致，無明顯改變。與模型組比較，半夏瀉心湯給藥后，大、中劑量組海馬區(qū)腦組織內(nèi)5-HT和DA含量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），氟西汀可升高海馬腦組織DA和5-HT含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體見表3。

表3 半夏瀉心湯對(duì)海馬區(qū)5-HT、DA和NA含量的影響

3.4 半夏瀉心湯對(duì)大鼠額葉皮層區(qū)DA和BDNF表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物額葉皮層區(qū)DA和BDNF表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，半夏瀉心湯3個(gè)劑量給藥組額葉皮層區(qū)DA表達(dá)面積（Area）和累積光密度（IOD）均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），氟西汀也可提高額葉皮層區(qū)DA表達(dá)。與DA表達(dá)稍有不同的是，半夏瀉心湯1.25 g·kg-1給藥組額葉皮層區(qū)BDNF表達(dá)與模型組比較沒有明顯差異，半夏瀉心湯2.5 g·kg-1和5 g·kg-1給藥組額葉皮層區(qū)BDNF表達(dá)面積（Area）和累積光密度（IOD）均較模型組明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體見圖1、圖2。

圖1 半夏瀉心湯對(duì)大鼠額葉皮層區(qū)DA表達(dá)的影響

圖2 半夏瀉心湯對(duì)大鼠額葉皮層區(qū)BDNF表達(dá)的影響

4 討論

抑郁癥是一種異質(zhì)性病癥，易損害認(rèn)知功能，病程時(shí)長(zhǎng)時(shí)短且容易復(fù)發(fā)。其臨床表現(xiàn)為情緒低落，思維遲鈍，言語動(dòng)作遲滯，對(duì)任何事情都提不起興趣等等；甚至悲觀厭世，有自殺企圖或行為；部分病例有明顯的焦慮和緊張激越；嚴(yán)重者可出現(xiàn)幻覺、妄想等精神病性癥狀。人類抑郁癥的核心癥狀即快感喪失。本試驗(yàn)采用的枷鎖法使大鼠“郁怒而不能發(fā)”，從而情志所傷造成的肝郁證模型。而實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物抑郁的重要特征是對(duì)獎(jiǎng)賞的反應(yīng)性下降，目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者采用液體消耗實(shí)驗(yàn)中糖水的消耗量和糖水偏愛百分比怍為衡量快感缺乏的有效的客觀的指標(biāo)[5]。本試驗(yàn)中采用雙瓶實(shí)驗(yàn)來衡量液體消耗實(shí)驗(yàn)中的各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果模型組大鼠1%蔗糖水消耗量明顯降低，蔗糖水偏愛百分比也明顯下降。提示這種模型能基本反映動(dòng)物對(duì)獎(jiǎng)賞的反應(yīng)能力的下降。半夏瀉心湯給藥4周后，給藥組大鼠蔗糖水的消耗量逐漸增加，提示半夏瀉心湯可明顯提高大鼠對(duì)糖水的偏愛程度。

cAMP具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成，增加CAMP濃度可以激活PKA，從而使某些基因調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，進(jìn)而激活特定的基因轉(zhuǎn)錄。模型組動(dòng)物海馬區(qū)組織cAMP和PKA水平明顯低于對(duì)照組，而血清中cAMP和PKA含量沒有明顯改變。半夏瀉心湯給藥后與模型組比較，各給藥組都明顯提高海馬區(qū)組織cAMP和PKA水平。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中單胺類遞質(zhì)代謝紊亂是抑郁癥的主要生化特征，5-HT、NA、DA為重要的單胺類中樞神經(jīng)遞質(zhì)，參與情感、睡眠、記憶、食欲和性功能的調(diào)節(jié)。模型組動(dòng)物海馬區(qū)組織5-HT和DA含量明顯低于對(duì)照組，模型組大鼠海馬組織NA含量與對(duì)照組基本一致，無明顯改變。半夏瀉心湯給藥后，與模型組比較，大、中劑量組海馬區(qū)腦組織內(nèi)5-HT和DA含量明顯升高。說明半夏瀉心湯可顯著提高肝郁證大鼠腦組織中單胺類遞質(zhì)的含量。

DA主要負(fù)責(zé)大腦的情欲、感覺，將興奮及開心的信息傳遞。一旦多巴胺分泌減少，向下傳遞的信號(hào)就無法很正確地傳遞到肢體，這個(gè)時(shí)候我們執(zhí)行的命令就可能是錯(cuò)誤的，或者根本沒有受到大腦控制。而BDNF有保護(hù)神經(jīng)元，抵抗損傷及促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)作用，腦內(nèi)BDNF的缺少，大腦相應(yīng)功能的紊亂則會(huì)導(dǎo)致抑郁。模型組動(dòng)物額葉皮層區(qū)DA和BDNF表達(dá)明顯低于對(duì)照組。與模型組比較，半夏瀉心湯3個(gè)劑量給藥組額葉皮層區(qū)DA表達(dá)面積（Area）和累積光密度（IOD）均明顯升高，氟西汀也可提高額葉皮層區(qū)DA表達(dá)。與DA表達(dá)稍有不同的是，半夏瀉心湯1.25 g·kg-1給藥組額葉皮層區(qū)BDNF表達(dá)與模型組比較沒有明顯差異，半夏瀉心湯2.5 g·kg-1和5 g·kg-1給藥組額葉皮層區(qū)BDNF表達(dá)面積（Area）和累積光密度（IOD）均較模型組明顯升高?？梢?，半夏瀉心湯對(duì)肝郁模型大鼠CAMP、PKA水平以及DA等都是有升高作用的，具有抗抑郁的作用。