HPLC測定市售青風(fēng)藤中青藤堿和木蘭花堿含量△

王青青，方明月，劉雙月，李德利，馬超，孫愛東*，王如峰*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomeniumactum(Thunb.)Rehd.et Wils.及毛青藤S.acutum(Thunb)Rehd.et Wils.var.cinereumRehd.et Wils.的干燥藤莖[1-2]。青風(fēng)藤分布于長江流域及其以南各地，如河北、河南、安徽、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西、湖北、四川、貴州、陜西等地[1]，毛青藤分布于湖北、四川、云南、貴州、陜西等地[2]。中醫(yī)應(yīng)用青風(fēng)藤或其復(fù)方治療風(fēng)濕性疾病已有一千多年的歷史[3]，《圖經(jīng)本草》和《本草綱目》中有記載“青風(fēng)藤治風(fēng)濕流注，歷節(jié)鶴膝，麻痹瘙癢……”[4]，《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)2015版一部收載青風(fēng)藤，并在防己黃芪湯、芪麝丸等復(fù)方中藥中有所應(yīng)用。青風(fēng)藤中含有多種生物堿類化學(xué)成分，包括青藤堿、木蘭花堿、尖防己堿、四氫表小檗堿、異青藤堿、土杜拉寧、N-去甲基尖防己堿、白蘭花堿、光千金藤堿等30多個生物堿[4]，主要成分為青藤堿和木蘭花堿?！吨袊幍洹穂5]中收載了青藤堿的含量測定項，并規(guī)定青風(fēng)藤中青藤堿的含量不得低于0.50%。木蘭花堿是青藤堿的同系物，二者都有類似的菲核結(jié)構(gòu)[6](見圖1)，且藥理作用也相似[7-10]。因此，木蘭花堿的含量對青風(fēng)藤的質(zhì)量評價也有重要價值。為此，本文建立了同時測定青風(fēng)藤中這兩個成分的含量測定方法，并利用該方法對從全國各地收集的62批市售青風(fēng)藤中青藤堿和木蘭花堿的含量進行了測定。

圖1 青藤堿和木蘭花堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀(Waters 公司)，BP211D 型 1/10 萬電子天平(Sartorious公司)，Synergi Polar -RP 苯基 C18色譜柱，KQ-500型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，400Y型多動能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

1.2 試劑與藥品

62批青風(fēng)藤飲片分別在2015—2018年購于全國14個省的藥材市場或中藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王如峰教授鑒定為正品，憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，樣品信息見表1。青藤堿、木蘭花堿對照品購于賽譜銳思(北京)科技有限公司，其純度不低于99%。色譜試劑乙腈為色譜純(Fisher公司，美國)，乙酸和乙醇均為分析純，水為市售屈臣氏蒸餾水。

表1 62批青風(fēng)藤飲片樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為 Synergi Polar-RP苯基C18柱(250 mm×4.6 mm，4m)，流動相為乙腈(B)-1%乙酸水溶液(A)，梯度洗脫(0～15 min，10%→15% B；15～17 min，15%→20% B；17～22 min，20%→40% B；22～30 min，40%→40% B)，柱溫為30 ℃，檢測波長為280 nm，流速為1 mL·min-1。采用上述色譜條件分別得到對照品和青風(fēng)藤飲片提取液的HPLC色譜圖，如圖2所示。樣品中青藤堿、木蘭花堿的保留時間分別為10.50、21.72 min，理論塔板數(shù)分別為1532和6060，拖尾因子分別為0.98和1.01。

注：A.混合對照品；B.樣品；1.青藤堿；2.木蘭花堿。圖2 青風(fēng)藤及對照品HPLC圖

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取對照品青藤堿10.06 mg和木蘭花堿10.03 mg，置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇水溶液溶解并稀釋至體積，4 ℃保存?zhèn)溆?。進樣前，取適量對照品溶液稀釋至0.1 mg·mL-1。

2.3 供試品溶液制備

稱取適量青風(fēng)藤飲片，用粉碎機粉碎至粉末，過三號篩。精密稱取0.10 g，置于50 mL錐形瓶中，用移液管加入70%乙醇水溶液20 mL，稱質(zhì)量。超聲提取30 min，放置室溫，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇水溶液補足減失的質(zhì)量。搖勻過濾，取續(xù)濾液，用0.45m微孔濾膜濾過[4-5，11]，即得供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密配制1 mg·mL-1的青藤堿和木蘭花堿對照品混合溶液，用70%乙醇水溶液分別稀釋得到質(zhì)量濃度為0.01、0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg·mL-1的對照品混合溶液。按上述色譜條件測定，分別進樣10L。以測定峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得到回歸方程，青藤堿：Y=5×106X-3 780.8(r=0.999 6)，木蘭花堿：Y=1×107X+67 608(r=0.999 5)，結(jié)果表明青藤堿和木蘭花堿在0.01～0.40 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

精密量取按2.2項下方法制成的青藤堿和木蘭花堿對照品溶液，連續(xù)進樣6次，進樣量均為10L，測定青藤堿和木蘭花堿的峰面積。據(jù)此計算青藤堿和木蘭花堿色譜峰的RSD分別為1.26%和0.36%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品(編號：QF090ZK02)溶液，分別在0、2、4、8、12、24、48 h各進樣1次，進樣量均為10L，根據(jù)峰面積考察樣品的穩(wěn)定性。計算得出青藤堿和木蘭花堿色譜峰的RSD分別為1.52%和1.83%，表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取供試品(編號：QF090ZK02)6份，按2.3制成供試品溶液，按2.1色譜條件分別進樣10L測定。計算青藤堿和木蘭花堿色譜峰的RSD分別為0.45%和0.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 檢測下限與定量下限測定

按2.2制成兩種對照品溶液，逐漸稀釋，按2.1色譜條件連續(xù)進樣，記錄峰面積，直至S/N=3 和S/N=10，此時的進樣量即分別為檢測下限(LOD)和定量下限(LOQ)。測得青藤堿和木蘭花堿的檢測下限分別為0.64、0.72 ng，定量下限分別為2.05、2.40 ng。

2.9 回收率試驗

精密稱取同一供試品(編號：QF051AG14)6份，每份 0.10 g，分別定量加入2種對照品，按2.3法制成供試液，按2.1色譜條件，測定樣品中相應(yīng)的生物堿含量，計算加樣回收率。青藤堿和木蘭花堿回收率分別為95.99%和99.11%，說明該方法的回收率良好。結(jié)果見表2。

表2 青風(fēng)藤中青藤堿和木蘭花堿的加樣回收率試驗結(jié)果

2.10 含量測定

取62批市售青風(fēng)藤飲片，按2.3制成供試品溶液，按2.1色譜條件每批測定3份，分別進樣10L，測得青藤堿和木蘭花堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.236%～4.735%和0.256%～3.682%，結(jié)果見表3。

3 討論與結(jié)論

本研究建立了青風(fēng)藤中青藤堿和木蘭花堿的 HPLC含量測定方法，并用該方法成功測定了來自全國各地的62批市售青風(fēng)藤中青藤堿和木蘭花堿的含量。除了4批經(jīng)性狀和顯微鑒定為混偽品未測出這兩個成分之外[12]，其余58批中青藤堿和木蘭花堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值分別為2.034%和1.293%。青藤堿最高值為4.735%，最低值為0.236%，只有一批樣品的含量低于2015版《中國藥典》規(guī)定的最低0.5%的要求。木蘭花堿最高值為3.682%，最低值為0.256%。以上數(shù)據(jù)說明，2015—2018年市場上銷售的青風(fēng)藤質(zhì)量基本符合《中國藥典》要求，但存在混偽品和個別正品青藤堿含量不合格的現(xiàn)象，并且合格正品中青藤堿和木蘭花堿的含量差異也較大。正品青風(fēng)藤中青藤堿和木蘭花堿含量差異較大可能與青風(fēng)藤的產(chǎn)區(qū)跨度大及各地氣候、土壤、栽培條件存在差別有關(guān)。另外，入藥物種的差別也是造成不同批次中青藤堿和木蘭花堿含量差異的因素。

表3 62批市售青風(fēng)藤中青藤堿和木蘭花堿的含量測定 %

注：—表示未檢測到。

經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，青藤堿和木蘭花堿的含量大體上呈正比趨勢，青藤堿含量高的青風(fēng)藤中木蘭花堿含量也相對偏高。這可能與兩個生物堿的結(jié)構(gòu)相似、生物合成路徑也相似有關(guān)。本研究建立的同時測定青風(fēng)藤中兩個生物堿的含量測定方法及測定結(jié)果，可為青風(fēng)藤的質(zhì)量評價提供科學(xué)參考。