沙漠嘎HPLC特征圖譜研究△

劉湉，馬群，王志鑫，高艷艷，姜悅，陳國超，李雙雙，楊飛，喬延江

(北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488)

沙漠嘎為菊科植物差不嘎蒿ArtemisiahalodendronTurcz.的嫩枝葉，首載于《中國沙漠地區(qū)藥用植物》，廣泛分布于我國西北、東北地區(qū)的沙漠中，在防風固沙方面發(fā)揮十分重要的作用[1-2]。沙漠嘎味辛性溫，具有止咳、祛痰、平喘、解表祛濕功能，可用于治療慢性氣管炎、哮喘、感冒、斑疹傷寒及風濕性關(guān)節(jié)炎等癥[1]，課題組前期研究表明沙漠嘎具有較好的抗炎平喘作用[3-5]，但目前沙漠嘎藥材尚缺乏規(guī)范的質(zhì)量標準。中藥特征圖譜具有整體性與模糊性兩大特點，能全面反映中藥材的質(zhì)量[6]，因此本研究采用高效液相色譜法建立沙漠嘎的對照特征圖譜，為該藥的相關(guān)研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(配置有G1311B四元泵，G1316A柱溫箱，G1315D DAD VL型二極管陣列檢測器)(美國安捷倫公司)；KH-250型速控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；電子天平BS-124S(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；ZDHW型可調(diào)式電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 材料

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(美國賽默飛世爾科技有限公司)；娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。對照品：李屬素(批號：B30213，純度≥98%，購于上海源葉生物科技有限公司)，甲基-3-(4′-羥苯基)香豆酸(自制，純度≥92%)、圣草酚-7-甲醚(由貴陽中醫(yī)學院提供，純度≥98%)、茵陳蒿香豆酸A(自制，純度≥98%)、異櫻花亭(批號YY95027，純度≥98%，購于上海源葉生物科技有限公司)。實驗用11批次沙漠嘎藥材于2014年7月至2017年7月采收于內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市與赤峰市，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定為差不嘎蒿ArtemisiahalodendronTurcz.的嫩枝葉，藥材具體信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相及洗脫條件：采用等度洗脫，0～122 min，乙腈-0.1%甲酸溶液(30∶70)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：288 nm；進樣量：10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取各批次沙漠嘎地上部分粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定其質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理30 min，放冷，再稱定其質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取李屬素、甲基-3-(4′-羥苯基)香豆酸、圣草酚-7-甲醚、茵陳蒿香豆酸A、異櫻花亭對照品適量，加甲醇制成每1 mL含李屬素160 μg、圣草酚-7-甲醚250 μg、甲基 3-(4′-羥苯基)香豆酸200 μg、茵陳蒿香豆酸A 25 μg、異櫻花亭260 μg的溶液，為混合對照品溶液。

3 方法學驗證

3.1 精密度試驗

精密吸取同一批次(S7)沙漠嘎地上部分樣品溶液，重復進樣6次，記錄色譜圖。以6(S)號峰的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，相對保留時間RSD在0.07%～0.54%，相對峰面積RSD在0.09%～4.11%，表明儀器精密度較好。

3.2 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一沙漠嘎地上部分樣品溶液(S7)，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進樣，以6(S)號峰為參照峰，計算相對值，相對保留時間RSD在0.22%～0.72%，相對峰面積RSD在0.14%～3.65%，表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 重復性試驗

取同一沙漠嘎地上部分樣品6份，各精密稱定2.0 g，按2.1項下處理得供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，以6(S)號峰作為參照峰，計算相對值，結(jié)果各主要共有峰相對保留時間的RSD小于0.19%～0.67%，相對峰面積的RSD在0.20%～5.07%，表明重復性較好。

表1 沙漠嘎樣品信息

4 結(jié)果

4.1 沙漠嘎地上部分HPLC特征圖譜的建立

取沙漠嘎地上部分粉末(過篩)11批，按2.1色譜條件進行檢測，采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A 版”軟件進行分析。自動匹配后生成對照特征圖譜(見圖1)。以對照特征圖譜為標準圖譜，分析S1～S11樣品相似度分別為0.978、0.944、0.885、0.971、0.973、0.974、0.781、0.949、0.963、0.980、0.868。

4.2 特征圖譜共有峰的確定

11批次沙漠嘎藥材特征圖譜見圖2，共含有8個共有特征峰，其中6號峰保留時間適中，峰面積較大且穩(wěn)定，峰形較好，故以6號峰(圣草酚-7-甲醚)為參照峰，11批次沙漠嘎共有峰的相對保留時間見表2，相對保留時間RSD在0.22%～2.18%，符合規(guī)定。

4.3 沙漠嘎HPLC特征圖譜中特征峰的指認

精密吸取混合對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，所得HPLC圖與已建立的 HPLC對照特征圖譜進行比對，指認特征峰，結(jié)果3號峰為李屬素、4號峰為甲基3-(4′-羥苯基)香豆酸、6號峰為圣草酚-7-甲醚、7號峰為茵陳蒿香豆酸A、8號峰為異櫻花亭，見圖1。

注：3.李屬素；4.甲基3-(4′-羥苯基)香豆酸；6.圣草酚-7-甲醚；7.茵陳蒿香豆酸A；8.異櫻花亭。圖1 沙漠嘎HPLC特征圖譜中特征峰的指認

圖2 11 批沙漠嘎藥材PHLC特征圖譜的疊加圖

5 討論

5.1 檢測波長的選擇

本研究中考察了210、270、288 nm下的供試品溶液色譜圖(見圖3)，以色譜圖中各色譜峰的分離度、數(shù)量、分布情況為考察指標，結(jié)果在210 nm下色譜峰較??；而在270 nm下色譜峰太少，288 nm下色譜圖中色譜峰的數(shù)量適中，且沙漠嘎中的大部分黃酮類成分在288 mm處均有吸收[7]，故選擇288 nm為檢測波長。

表2 沙漠嘎共有峰相對保留時間(以圣草酚-7-甲醚為參照)

圖3 沙漠嘎檢測波長的選擇

5.2 色譜柱的選擇

由于沙漠嘎成分復雜，色譜峰分離難度較大，在HPLC特征圖譜建立過程中對Agilent Extend-C18、Agilent Eclipse Plus C18兩種類別的色譜柱進行了考察(見圖4)，發(fā)現(xiàn)使用不同色譜柱所得結(jié)果會有明顯差異，其中，Agilent Eclipse Plus C18系列色譜柱雖分離時間較另一種色譜柱稍長，但分離效果最好，同時重現(xiàn)性較好，故選擇該色譜柱用于沙漠嘎HPLC特征圖譜研究。

圖4 沙漠嘎含量測定的色譜柱選擇

6 結(jié)論

本研究建立的HPLC特征圖譜能夠較為全面地反映沙漠嘎所含化學成分信息，可為沙漠嘎的質(zhì)量評價與資源開發(fā)利用提供參考。比較不同批次的沙漠嘎藥材HPLC特征圖譜，發(fā)現(xiàn)雖整體差異不大，但不同產(chǎn)地或批次藥材所含特征成分的含量仍存在一定差異，其中S3、S7、S11的相似度較其他批次藥材略低，推測沙漠嘎藥材的質(zhì)量存在地域差異，而不同產(chǎn)地氣候、環(huán)境及土壤條件等因素的差異很可能是導致該地域差異的主要原因[8]。