不同性別大白豬肌肉全基因組高分辨率單堿基甲基化差異分析

郭添福，張志燕，陳 冬，姚天雄，肖石軍，黃路生

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

DNA甲基化作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、基因組印記、細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。所有組織或細(xì)胞普遍存在DNA甲基化和非甲基化機(jī)制，不同性別DNA甲基化水平是否存在差異是一個(gè)普遍關(guān)注的研究熱點(diǎn)。El-Maarri等[2]通過(guò)比較不同性別健康人體全血基因組ALU、LINE-1 重復(fù)序列的甲基化水平差異，證實(shí)其所有CpG島的甲基化水平男性均顯著高于女性。Fuke等[3]和Shimabukuro等[4]都發(fā)現(xiàn)，外周血白細(xì)胞男性甲基化水平顯著高于女性。此外，Xiao等[5]發(fā)現(xiàn)，人類肝中DNMT3a表達(dá)水平在兩性之間相似，而女性的DNMT3b表達(dá)水平顯著高于男性。以上結(jié)果顯示，性別可能是影響DNA甲基化狀態(tài)的重要因素之一，但有研究認(rèn)為，不同性別的DNA甲基化水平無(wú)顯著差異[6-7]。白小青等[8]研究發(fā)現(xiàn)，30日 齡榮昌公豬的DNA甲基化含量高于母豬，但在統(tǒng)計(jì)上無(wú)顯著性差異。隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，全基因組甲基化測(cè)序在動(dòng)物研究中越來(lái)越受到關(guān)注，但到目前為止，還未見(jiàn)大白豬不同性別間全基因組高分辨率單堿基甲基化水平差異分析的報(bào)道。

本研究利用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序法(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)對(duì)不同性別大白豬肌肉組織的甲基化水平進(jìn)行了分析，初步揭示豬性別差異的表觀調(diào)控機(jī)制，為深入開(kāi)展不同性別豬肌肉的分子調(diào)控研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中大白豬來(lái)自江西樟樹(shù)綠環(huán)牧業(yè)集團(tuán)法系育種核心群，屠宰210 日齡健康公母豬各 2頭，采集背最長(zhǎng)肌組織，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 大白豬背最長(zhǎng)肌全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(WGBS)

1.2.1 DNA提取及樣品檢測(cè) 利用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿法提取基因組DNA，使用分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度，瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有RNA污染，Nanodrop檢測(cè)DNA的純度(OD260 nm/OD280 nm比值)，用Qubit對(duì)DNA濃度進(jìn)行精確定量。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建 檢測(cè)合格的基因組DNA樣品，首先用Bioruptor (Diagenode, Belgium) 打斷成平均大小為 200～300 bp的片段，對(duì)打斷后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、3′端加A堿基，并連接甲基化接頭；隨后進(jìn)行Bisulfite處理(采用EZ DNA Methylation Gold Kit, Zymo Research)；用 2% 的瓊脂糖凝膠電泳選擇片段；用QIAquick Gel Extraction kit(Qiagen)回收DNA片段。

1.2.3 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè) 文庫(kù)構(gòu)建完成后，用Agilent 2100 檢測(cè)文庫(kù)DNA片段的完整性及插入片段大小，符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行檢測(cè)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1.2.4 上機(jī)測(cè)序 DNA文庫(kù)檢測(cè)合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求做pooling后進(jìn)行Hiseq測(cè)序，測(cè)序策略為雙末端測(cè)序。測(cè)序地點(diǎn)為北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.3 大白豬背最長(zhǎng)肌全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

1.3.1 參考序列比對(duì)分析 將獲得的原始測(cè)序序列數(shù)據(jù)(Raw data)進(jìn)行過(guò)濾，包括剔除帶接頭的reads，剔除未能確定堿基比例超過(guò) 10% 的reads，剔除低質(zhì)量的reads(質(zhì)量值沒(méi)有超過(guò)20的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上的reads)。得到的過(guò)濾后數(shù)據(jù)通過(guò)比對(duì)軟件BSMAP[9](采用默認(rèn)參數(shù))比對(duì)到豬的參考基因組上(Sscrofa 11.1版本，下載地址：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Sus_scrofa/Assembled_chromosomes/seq)，并計(jì)算每個(gè)樣品的比對(duì)率和bisulfite(BS) 轉(zhuǎn)化率等信息。

目前，微波檢測(cè)領(lǐng)域的研究主要集中在微波介質(zhì)材料的研究上.溶液物質(zhì)在微波場(chǎng)中的行為與自身的極性有著密切的關(guān)系.極化程度可以由介電常數(shù)加以表示.溶液物質(zhì)的介電常數(shù)通常與外界因素如濃度，溫度和頻段等存在一個(gè)確定的非線性關(guān)系[4].可以利用這種關(guān)系確定液體的成分.

1.3.2 測(cè)序深度統(tǒng)計(jì) 每個(gè)堿基位點(diǎn)比對(duì)到染色體上的讀長(zhǎng)數(shù)即為該位點(diǎn)的測(cè)序深度。計(jì)算CG、CHH和CHG 3種序列環(huán)境(H代表A、T和C 堿基)下C位點(diǎn)的測(cè)序深度。

1.3.3 不同序列環(huán)境下胞嘧啶甲基化分析 對(duì)包括甲基化位點(diǎn)(mC)在內(nèi)共 10 bp堿基統(tǒng)計(jì)作圖(上游4個(gè)堿基，下游5個(gè)堿基)，研究不同序列環(huán)境下甲基化胞嘧啶上下游的序列特征，可為甲基化預(yù)測(cè)提供依據(jù)。

1.3.4 甲基化組DMR分析 差異甲基化區(qū)域(differentially methylated region，DMR)是在多樣本間甲基化程度存在差異的一段基因組區(qū)域。DMR是一種重要的表觀遺傳學(xué)研究對(duì)象，可通過(guò)多種途徑調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響生物學(xué)功能。本試驗(yàn)采用SMART軟件(2.2.1版本，采用默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行DMR分析[10]。

1.3.5 聚類分析 采取層次聚類法分析樣本間DMRs的相互關(guān)系及差異趨勢(shì)，以探究甲基化差異的生物學(xué)意義。

1.3.6 DMRs相關(guān)基因的GO和KEGG富集分析 利用BEDTOOLS2軟件(2.25.0版本)進(jìn)行基因注釋，得到差異甲基化基因(differentially methylated gene，DMG)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[11]將DMGs進(jìn)行生物本體分析(GO)和代謝通路(KEGG)富集分析。對(duì)DMGs進(jìn)行富集分析，可以為生物學(xué)過(guò)程相關(guān)研究提供候選基因。

2 結(jié) 果

2.1 豬背最長(zhǎng)肌全基因組參考序列比對(duì)分析

2.1.1 豬背最長(zhǎng)肌全基因組Reads與參考基因組比對(duì)情況統(tǒng)計(jì) 對(duì) 4個(gè)樣品進(jìn)行WGBS測(cè)序，平均每個(gè)樣品產(chǎn)出 150.765 Gb過(guò)濾后數(shù)據(jù)。經(jīng)計(jì)算，平均每個(gè)樣品得到 2 374 661 943 bp的唯一匹配堿基，平均唯一匹配率為 96.67%，平均BS轉(zhuǎn)化率為 99.62%，30×平均覆蓋率為 73.45%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1讀長(zhǎng)與參考基因組比對(duì)情況

Table1Thecomparisonofreadstothereferencegenome

指標(biāo)Index公豬_1 Boar_1公豬_2Boar_2母豬_1Sow_1母豬_2Sow_2平均Average總堿基數(shù)/bp Clean base number2 456 425 2042 456 371 7242 456 394 4932 456 380 0262 456 392 862匹配上堿基數(shù)/bp Mapped base number2 439 649 4742 440 580 7932 424 302 8792 439 262 3412 435 948 872匹配率/% Mapping rate99.3299.3698.6999.3099.17唯一匹配上堿基數(shù)/bp Unique mapped bases number2 379 110 1622 381 498 5402 359 996 4842 378 042 5862 374 661 943唯一匹配率/% Uniquely mapping rate96.8596.9596.0896.8196.67BS轉(zhuǎn)化率/% BS conversion rate99.5899.6399.6299.6799.62平均深度(×) Average depth26.5631.7822.9930.7128.0130× 覆蓋率/% Coverage rate73.6073.6773.1473.4073.45

2.1.2 豬背最長(zhǎng)肌全基因組測(cè)序深度統(tǒng)計(jì) 根據(jù)單個(gè)堿基位點(diǎn)的讀長(zhǎng)數(shù)計(jì)算測(cè)序深度及其累積分布。分析顯示，位于測(cè)序深度為(10×)～(30×)區(qū)段的位點(diǎn)最多，基本呈現(xiàn)正態(tài)分布趨勢(shì)，見(jiàn)圖1B；超過(guò) 80% 的全基因組位點(diǎn)擁有 15× 以上測(cè)序深度，見(jiàn)圖1A，說(shuō)明單位點(diǎn)覆蓋率高，測(cè)序范圍廣，結(jié)果可信。

圖1 大白豬背最長(zhǎng)肌基因組測(cè)序深度分布(A)和累積分布(B)
Fig.1 Genome coverage distribution(A) and cumulative distribution(B) of sequencing depth of genome in Large White pigs LD

柱狀圖表示各染色體讀長(zhǎng)的平均測(cè)序深度，散點(diǎn)圖表示每條染色體讀長(zhǎng)的覆蓋率
Histogram represent the average sequencing depth of reads in different chromosomes, scatter diagram represent coverage rate of reads on each chromosome
圖2 覆蓋率和讀長(zhǎng)在各染色體上的分布
Fig.2 Distribution of reads and coverage rate on each chromosome

2.2 豬背最長(zhǎng)肌全基因組甲基化水平分析

2.2.1 豬背最長(zhǎng)肌全基因組甲基化C位點(diǎn)分布分析 在全基因組范圍約有 5% 的胞嘧啶被甲基化(mC/C)。根據(jù)胞嘧啶(C)序列特征可以將其分為CG、CHH和CHG(H代表A、T或C 堿基)3種序列環(huán)境[12]，CG環(huán)境甲基化占總甲基化的比率(mCG/mC)在3種環(huán)境中最高；甲基化主要發(fā)生在CG環(huán)境，mCHG/CHG和mCHH/CHH環(huán)境中甲基化所占比例均不超過(guò) 1%；母豬的平均mCG/CG水平要高于公豬。大白豬全基因組胞嘧啶甲基化情況見(jiàn)表2。

2.2.2 豬背最長(zhǎng)肌全基因組甲基化密度圖譜 不同性別不同序列環(huán)境的全基因組甲基化密度見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示，不同個(gè)體部分染色體以及不同序列環(huán)境的甲基化密度存在差異。

2.2.3 豬背最長(zhǎng)肌全基因組染色體甲基化水平分析 所有個(gè)體不同染色體甲基化水平的差異和趨勢(shì)見(jiàn)圖4，除母豬_1的CHG與CHH環(huán)境的甲基化分布情況外，其余個(gè)體不同環(huán)境下甲基化分布趨勢(shì)基本一致。所有個(gè)體的甲基化程度(mC/C)均在12號(hào)染色體最高。

2.2.4 豬背最長(zhǎng)肌全基因組基因功能區(qū)域甲基化水平分析 為更好地理解基因3′UTR、5′UTR、外顯子、內(nèi)含子和啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2kb的區(qū)域)等不同功能元件的甲基化水平，將每個(gè)基因的各個(gè)功能區(qū)域分別等分成20個(gè)單位長(zhǎng)度，再對(duì)所有基因的功能元件區(qū)域相應(yīng)單位長(zhǎng)度的C位點(diǎn)甲基化水平求平均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示，所有個(gè)體不同基因功能元件在3種環(huán)境的甲基化水平均相似；不同基因功能元件的甲基化水平存在差異，其中，CG環(huán)境下內(nèi)含子和3′UTR的甲基化水平普遍較高，5′UTR的甲基化程度較低。

表2大白豬全基因組胞嘧啶甲基化情況

Table2Genome-widemethylationlevelofcytosineinLargeWhitepigs

組別Group公豬_1Boar_1公豬_2Boar_2平均Average母豬_1Sow_1母豬_2Sow_2平均AveragemC/C/%4.815.054.934.804.904.85mCG數(shù)/個(gè)mCG number 39 048 95839 519 68039 284 31939 307 46640 134 30839 720 887mCG/mC/%87.6588.488.0286.0888.6987.39mCG/CG /%70.8671.3371.09572.0872.9672.52mCHG數(shù)/個(gè)mCHG number1 299 8181 243 2571 271 5371 441 3371 215 1851 328 261mCHG/mC/%2.922.782.853.162.692.92mCHG/CHG /%0.630.600.6150.700.590.65mCHH數(shù)/個(gè)mCHH number4 204 2463 942 1044 073 1754 914 3063 903 4374 408 872mCHH/mC/%9.448.829.1310.768.639.69mCHH/CHH/%0.610.570.590.730.570.65

圈由外向內(nèi)依次為參考基因組、公豬_1、公豬_2、母豬_1和母豬_2。紅色和綠色分別代表高甲基化水平和低甲基化水平
The circles from the outside to inside represent reference genome, boar_1, boar_2, sow_1 and sow_2, respectively. Circles display high methylation level in red and low methylation level in green
圖3 不同序列環(huán)境(mCG、mCHG和mCHH)甲基化密度圖譜
Fig.3 Methylation density maps of mCG, mCHG and mCHH

橫坐標(biāo)代表染色體號(hào)，縱坐標(biāo)代表不同序列環(huán)境下各染色體上甲基化的平均水平
The abscissa represent different chromosomes, and the ordinate represent methylation level of different chromosomes in different contexts
圖4 C位點(diǎn)平均甲基化程度在染色體上的分布
Fig.4 The average level distribution of methylation at C on chromosomes

2.3 豬背最長(zhǎng)肌全基因組在不同序列環(huán)境下胞嘧啶甲基化分析

通過(guò)對(duì)不同序列環(huán)境下甲基化位點(diǎn)的序列偏好分析發(fā)現(xiàn)，mCHG中的第2位H大部分以T居多，A 次之；mCHH第2位H以C 為主，第3位H以T 為主，見(jiàn)圖6。

2.4 豬背最長(zhǎng)肌全基因組DMR分析

2.4.1 豬背最長(zhǎng)肌全基因組DMR鑒定結(jié)果及結(jié)構(gòu)注釋 在不同性別大白豬的背最長(zhǎng)肌組織中鑒定出CG、CHH和CHG環(huán)境下顯著的DMRs分別為118、0和1511個(gè)，共鑒定到1 629個(gè)DMRs。DMRs長(zhǎng)度主要集中在20～300 bp，最長(zhǎng)的出現(xiàn)在第 4號(hào)染色體上，達(dá)到 1 104 bp；越長(zhǎng)的DMRs出現(xiàn)的頻率越低，見(jiàn)圖7A；性別差異分析顯示，母豬的DMRs甲基化水平明顯高于公豬，見(jiàn)圖7B；不同染色體DMRs長(zhǎng)度分布呈多態(tài)性，見(jiàn)圖7C。

通過(guò)對(duì)DMRs進(jìn)行注釋，共鑒定出 841 個(gè)DMGs，CG和CHH環(huán)境下發(fā)生甲基化最多的元件為基因間區(qū)，其次是內(nèi)含子區(qū)，具體結(jié)果見(jiàn)圖8(圖中不同顏色代表不同功能元件所占的比率)。

2.4.2 豬背最長(zhǎng)肌全基因組DMRs聚類分析 對(duì)不同樣本之間的DMRs進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，相同性別的DMRs聚類在一起，不同性別間DMRs聚類差異顯著，見(jiàn)圖9。

2.4.3 豬背最長(zhǎng)肌全基因組DMGs相關(guān)GO和KEGG富集分析 經(jīng)過(guò)GO富集分析，共檢測(cè)到顯著相關(guān)的GO條目(P<0.05)171 個(gè)，涉及生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成以及分子功能3大類，這些DMGs顯著富集在軸突導(dǎo)向(GO: 0007411)、細(xì)胞連接(GO: 0030054)、細(xì)胞黏附(GO: 0050839)等相關(guān)過(guò)程。圖10 展示了 30 個(gè)最顯著GO條目。對(duì)不同性別DMGs進(jìn)行KEGG富集分析，共得到 10 個(gè)相關(guān)信號(hào)通路(P<0.05)，顯著富集在ECM受體互作(hsa04512)等通路，詳情見(jiàn)圖11。

將每個(gè)基因的各個(gè)功能區(qū)域分別等分成20個(gè)單位長(zhǎng)度，再計(jì)算每個(gè)單位長(zhǎng)度的甲基化水平求平均值繪制成折線圖。橫坐標(biāo)代表不同的基因組功能元件，縱坐標(biāo)為不同序列環(huán)境下各功能元件的甲基化水平。不同顏色代表不同序列環(huán)境(CG、CHG和CHH)
Each element of each gene was divided into 20 bins and the average of all bins in each gene elements was obtained. The abscissa represent different gene elements, and the ordinate represent methylation levels of elements in different sequence contexts. Different colors represent different sequence contexts (CG, CHG and CHH)
圖5 甲基化水平在不同基因組功能元件上的分布
Fig.5 Distribution of methylation level in different genomic components

橫坐標(biāo)為堿基位置，mC的位置定義為0，縱坐標(biāo)為相應(yīng)位置堿基的富集程度，每個(gè)位置的總高度為堿基的序列含量
The abscissa represent bases position, the position of mC is defined as 0, and the ordinate represent the degree of base enrichment, the total height of each position is the sequence content of the base
圖6 不同序列環(huán)境下的胞嘧啶甲基化
Fig.6 Cytosine methylation in different sequence contexts

A圖橫坐標(biāo)代表DMRs長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)代表對(duì)應(yīng)DMRs長(zhǎng)度的頻率；B圖橫坐標(biāo)為不同性別，縱坐標(biāo)代表DMRs甲基化水平分布；C圖橫坐標(biāo)代表染色體編號(hào)，縱坐標(biāo)代表DMRs長(zhǎng)度分布
The abscissa represents DMRs length, the ordinate represents the frequency of different DMRs length in figureA；The abscissa represents gender, the ordinate represents the methylation level of DMRs in figureB；The abscissa represents different chromosome, and the ordinate represents the distribution of DMRs length in figure C
圖7 DMRs長(zhǎng)度和水平分布
Fig.7 Distribution of DMRs length and level

圖8 不同序列環(huán)境DMRs所在基因功能元件的百分比
Fig.8 The percentage of DMRs in different gene elements in different sequence contexts

為了更好地理解DNA甲基化與不同性別肌肉差異的相關(guān)性，本研究設(shè)置2個(gè)限制因素進(jìn)行候選基因篩選：1)選擇GO分析中富集于肌肉相關(guān)通路的DMGs；2)第一步選擇的DMGs需要顯著富集在KEGG分析中的信號(hào)通路(剔除癌癥相關(guān)通路)。結(jié)果得出，有 2個(gè)GO條目與肌肉相關(guān)通路有關(guān)，即平滑肌細(xì)胞遷移負(fù)調(diào)控(GO:0014912)和肌肉器官發(fā)育(GO:0007517)，包含 14 個(gè)DMGs，其中有5個(gè)DMGs富集在KEGG分析中的信號(hào)通路(DMD、ITGA7、LMNA、SEMA6D和SLIT2)，具體信息見(jiàn)表3。

行代表個(gè)體號(hào),列代表個(gè)體的DMR
Each row represent an individual and each column represent an individual DMR
圖9 大白豬不同樣本DMRs聚類分析
Fig.9 DMRs cluster analysis in different samples of Large White pigs

縱坐標(biāo)代表GO條目；橫坐標(biāo)代表-lg(P-value)
The ordinate represents the GO terms, the abscissa represents the -lg(P-value)
圖10 最顯著30個(gè)GO條目的柱狀圖
Fig.10 The histogram of top 30 GO terms

縱坐標(biāo)代表KEGG條目；橫坐標(biāo)代表富集因子。圈的大小代表通路的基因數(shù)，圈越大，基因數(shù)越多。不同顏色代表-lg(P-value),顏色越紅，-lg(P-value)越大
The ordinate represents the KEGG terms and the abscissa represents the rich factor. The size of circles represent the number of genes contained in the particular class, the larger the circle indicate the more genes. The different colors represent the -lg(P-value), the redder the circles indicate the higher -lg(P-value)
圖11 KEGG條目氣泡圖
Fig.11 The bubble chart of KEGG terms

3 討 論

豬是人類最主要的動(dòng)物蛋白來(lái)源，肉質(zhì)作為養(yǎng)豬生產(chǎn)中的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀，已經(jīng)越來(lái)越受到研究者、生產(chǎn)者和廣大消費(fèi)者的重視。

DNA甲基化作為重要的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象之一，能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象和轉(zhuǎn)錄效率等多方面的改變，從而調(diào)控基因表達(dá)[13]。近年來(lái)，豬的全基因組甲基化方面雖有研究，但主要采用的是DNA甲基化免疫共沉淀測(cè)序法[14-23]和簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序法[23-25]，雖然有極少數(shù)研究利用“金標(biāo)準(zhǔn)”重亞硫酸鹽進(jìn)行甲基化測(cè)序法[26-28]，但覆蓋度太低；主要集中在不同品種、不同組織或不同處理方式之間的甲基化差異分析，尚未見(jiàn)不同性別間肌肉全基因組甲基化差異的報(bào)道。本試驗(yàn)利用WGBS研究不同性別大白豬的背最長(zhǎng)肌全基因組高分辨率單堿基甲基化差異，系統(tǒng)地比較了不同性別大白豬背最長(zhǎng)肌全基因組甲基化的差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，基因組中大約有 5% 的C位點(diǎn)被甲基化，不同性別間胞嘧啶甲基化水平差異不顯著，與此前相關(guān)報(bào)道類似[8]。CG環(huán)境甲基化比率在3種環(huán)境中最高，與此前報(bào)道的結(jié)果一致[20-22,26-27]。不同性別功能元件區(qū)的全基因組甲基化模式相似，CG、CHG和CHH 3種序列環(huán)境的甲基化差異可能與不同遺傳元件差異有關(guān)。

大部分DMRs為20～300 bp，說(shuō)明小片段區(qū)域C位點(diǎn)甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)起重要作用。不同序列環(huán)境下DMGs的功能元件區(qū)分布一致，CG和CHH環(huán)境主要集中在基因間區(qū)和內(nèi)含子區(qū)，其他功能元件區(qū)分布均較少。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，基因間區(qū)和基因的內(nèi)含子區(qū)約占整個(gè)基因組的99%，所以大多數(shù)的甲基化位點(diǎn)出現(xiàn)在基因間區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域；另一方面，啟動(dòng)子等功能區(qū)域的甲基化會(huì)阻抑基因的表達(dá)，尤其是眾多的看家基因以及早期就需要表達(dá)的基因，這些基因的功能區(qū)域都基本沒(méi)有發(fā)生甲基化，而內(nèi)含子和基因間區(qū)的甲基化所涉及的調(diào)控功能較少，故非功能區(qū)間的甲基化位點(diǎn)更多。

在GO分析中，841 個(gè)DMGs中有 757 個(gè)富集在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能。通過(guò)2個(gè)嚴(yán)格的因素(一是選擇GO分析中富集于肌肉相關(guān)通路的DMGs；二是第一步選擇的DMGs需要顯著富集在KEGG分析中的信號(hào)通路(剔除癌癥相關(guān)通路))篩選出5個(gè)可能與不同性別肌肉調(diào)節(jié)相關(guān)的DMGs：DMD、ITGA7、LMNA、SEMA6D 和SLIT2。DMD基因(抗肌肉萎縮蛋白基因)發(fā)生無(wú)義突變或框移突變而引起進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，該癥是一種常見(jiàn)的X連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉疾病，包括Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良和Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良，主要表現(xiàn)為容易跌倒，蹲站困難，喪失獨(dú)立行走能力等[29-33]。ITGA7基因(整合素α7基因)是整合素家族的重要成員之一，編碼的整合蛋白α7為心肌和骨骼肌層黏蛋白受體，與肌萎縮蛋白糖蛋白復(fù)合物類似，連接細(xì)胞外基質(zhì)到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架內(nèi)部，該蛋白具有治療DMD的潛質(zhì)[34]。LMNA基因(核纖層蛋白基因)編碼的核纖層蛋白對(duì)核穩(wěn)定、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)有重要作用，為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖所必需[35-38]，協(xié)助維持骨骼肌的體積和強(qiáng)度[39]，該基因突變是引起阻滯型家族性擴(kuò)張型心肌病最常見(jiàn)的致病基因[40]。SLIT2 基因?yàn)镾lit家族成員之一，編碼的Slit2蛋白能阻止血小板源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移[41]。SEMA6D 基因是Semaphorin家族成員之一，在肌肉、胚胎和腦等組織中均有表達(dá)，該基因與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生及軸突的形成有密切關(guān)系[42]；在胚胎的發(fā)育過(guò)程中，該基因通過(guò)與不同受體結(jié)合，能抑制或誘導(dǎo)心不同部位上皮細(xì)胞的遷移，從而在胚胎心血管的形態(tài)發(fā)生中起重要作用[43]，未見(jiàn)該基因參與肌肉發(fā)育相關(guān)過(guò)程的報(bào)道，其生物學(xué)功能有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

本研究全面構(gòu)建了大白豬背最長(zhǎng)肌高分辨率單堿基的全基因組甲基化圖譜，并解析了性別差異的甲基化區(qū)域和基因，共檢測(cè)到 1 629 個(gè)DMRs和 841 個(gè)DMGs，雖然不同性別總體甲基化水平相似，但母豬的DMRs平均甲基化水平明顯高于公豬。通過(guò)富集分析，獲得 171 個(gè)GO條目和 10 個(gè)KEGG條目，篩選出 5個(gè)與不同性別肌肉相關(guān)的候選基因，可為未來(lái)從遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)角度研究豬肉質(zhì)性狀及人類試驗(yàn)動(dòng)物模型的開(kāi)發(fā)提供重要參考。