gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞生物學行為的影響

余祖華，丁 軻*，郁 川，賈艷艷，何 雷，廖成水，李 靜，張春杰，李銀聚，吳庭才，程相朝，2，張夢珂，邱靜靜，羅 俊，3

(1.河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471023；2.洛陽職業(yè)技術學院，洛陽 471003； 3. 河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，農業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002)

腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中涉及多種分子調控機制，其中microRNA(miRNA)對腫瘤的調控作用是目前學術界研究的熱點之一。目前已在多種腫瘤組織及細胞系中檢測到miRNA的異常表達，腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、轉移等多種生物學過程都與miRNA密不可分，它可通過調節(jié)體內某些抑癌基因或癌基因的表達而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的致癌或抑癌功能[1-4]。致瘤性病毒在動物腫瘤轉化中發(fā)揮著至關重要的作用，近年來的研究表明miRNAs 也參與病毒誘導的腫瘤發(fā)生[5-7]。

馬立克病(Marek’s disease，MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)感染雞后引起的一種以淋巴細胞增生為主要特征的腫瘤性疾病，是病毒誘導淋巴瘤發(fā)生的較理想的動物模型[8]。近年來，在MD模型系統(tǒng)里開展了多項有關宿主和病毒miRNAs的研究[9-10]，Burnside等[11]在MDV感染的雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblasts，CEF)里鑒定了63個miRNAs，gga-miR-let-7、gga-miR-199a、gga-miR-26a、gga-miR-181a、gga-miR-16等宿主基因在MDV誘導的腫瘤中的表達量下調，表明其在腫瘤發(fā)生中具有潛在的調控作用。Yao等[12]發(fā)現(xiàn)在MDV轉化的細胞系中gga-miR-155、gga-miR-150、gga-miR-451、gga-miR-26a、gga-miR-223的表達量也呈下調表達，Lian等[13]研究發(fā)現(xiàn)在MDV感染的肝腫瘤組織、外周血淋巴細胞中gga-miR-181a、gga-miR-26a、gga-miR-221、gga-miR-222、gga-miR-199*和gga-miR-140*的表達量呈下調表達，gga-miR-146c呈上調表達，MDV感染的腫瘤組織和細胞中gga-miR-155表達量雖與非感染組織和細胞中的表達量差異不顯著，但總的趨勢是下調的。這些miRNAs表達的差異表明它們參與了MDV誘導的淋巴瘤轉化，在腫瘤的轉化中具有重要的作用。目前已經研究證實下調表達的gga-miR-26a[14]、gga-miR-181a[15]在MDV致腫瘤過程中可發(fā)揮“抑瘤”作用，其他下調表達的miRNAs在MDV致腫瘤過程中的作用還需進一步的研究證實。

研究表明miR-155在機體免疫功能的調節(jié)、惡性淋巴腫瘤形成等方面具有重要的生物學功能，在諸多人的腫瘤性疾病中miR-155均呈上調表達，表現(xiàn)為“致癌”功能。雖然有研究報道gga-miRNA-155是MDV1-miR-M4的功能性同源體[16]，但是在MDV轉化的T淋巴細胞系及MDV感染后的脾腫瘤組織及肝淋巴瘤中gga-miRNA-155均呈下調表達[12-13]。那么，在MD腫瘤發(fā)生中，gga-miRNA-155是發(fā)揮“致癌”功能還是“抑癌”功能還需進一步的驗證。因此，為了明確gga-miRNA-155在MD腫瘤發(fā)生中的“致癌”或“抑癌”功能，本研究利用MDV轉化的T淋巴細胞系MBS1細胞為模型，通過將人工合成gga-miRNA-155模擬物以及抑制物瞬時轉染MDCC-MSB1細胞，觀察gga-miRNA-155對MDCC-MSB1細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、遷移、侵襲能力的影響，為揭示gga-miRNA-155在MDV致瘤過程中的作用提供新的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 馬立克病毒轉化的腫瘤細胞系MDCC-MSB1為河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和耗材 Trizol RNA提取試劑、轉染試劑LipofectamineTM2000均購自Invitrogen公司；SYBR Premix ExTaqTM購自TaKaRa公司；HiScript逆轉錄酶購自Vazyme公司；RNA酶抑制劑購自Trans公司；AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；CCK8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自Biosharp公司；24孔板Transwell購自Corning公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；Penicillin-Streptomycin Solution購自Hyclone公司；胰蛋白胨磷酸肉湯(TPB)購自Sigma公司，其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 ABI7900熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，酶標儀(美國Thermo公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)，流式細胞儀(美國Beckman公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo公司)等。

1.2 方法

1.2.1 gga-miR-155模擬物以及gga-miR-155抑制物合成 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫中gga-miR-155成熟體序列委托廣州銳博生物科技有限公司合成gga-miR-155模擬物(gga-miR-155 mimic)、gga-miR-155模擬物陰性對照(gga-miR-155 mimic NC)、gga-miR-155抑制物(gga-miR-155 inhibitor)和gga-miR-155抑制物陰性對照(gga-miR-155 inhibitor NC)。

1.2.2 熒光定量引物的設計與合成 根據(jù)miRBase 數(shù)據(jù)庫中gga-miR-155成熟體序列，用Primer 5.0軟件設計gga-miR-155的莖環(huán)反轉錄引物和熒光定量PCR擴增引物，同時設計內參U6的莖環(huán)反轉錄引物和熒光定量PCR引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1Real-timePCR引物序列

Table1Real-timePCRprimersequences

名稱Name引物序列(5′→3′) Primer sequences用途ApplicationU6 loop primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGC-ACTGGATACGACCGATACA反轉錄U6 forward primerCGCTTCGGCAGCACATATAC Real-time PCRgga-miR-155 loop primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA-CTGGATACGACCCCCTATC反轉錄gga-miR-155 forward primerTGCGCTTAATGCTAATCGTGATReal-time PCRUniversal reverse primerCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTReal-time PCR

1.2.3 MDCC-MSB1細胞培養(yǎng)和轉染 MDCC-MSB1細胞用含10% FBS、1% Penicillin-Streptomycin Solution和10% TPB的RPMI1640 培養(yǎng)基，5% CO2、 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的MDCC-MSB1細胞，用上述培養(yǎng)基調整細胞密度到3×105·mL-1，接入6孔板，每孔1 mL細胞懸液。根據(jù)Lipofectamine TM2000 操作說明，每孔轉染gga-miR-155模擬物、gga-miR-155抑制物及相應陰性對照各 100 nmol，6 h后換正常培養(yǎng)液，在轉染 48 h后收集細胞進行相關檢測及功能試驗。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測MDCC-MSB1細胞中gga-miR-155的表達水平 于轉染48 h后收集各組MDCC-MSB1細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，定量后取1 μg的總RNA使用莖環(huán)反轉錄引物(表1)將其反轉錄為cDNA，然后用特異性的熒光定量引物(表1)進行Real-time PCR試驗。反轉錄反應體系及反應條件：500 ng RNA 2 μL， 5× Hiscript Buffer 4 μL，Hiscript Reverse Transcriptase 1 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，Loop primer 2 μL，RNase free water 9.5 μL；25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。Real-time PCR反應體系及反應條件：2×SYBR Premix ExTaq10 μL，反轉錄產物2 μL，F(xiàn)orward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，去離子水7 μL；50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。U6作為內參。采用2-ΔΔCt法分析Real-time PCR試驗數(shù)據(jù)，比較各組MDCC-MSB1細胞中gga-miR-155相對表達量的差異。

1.2.5 CCK-8法檢測MDCC-MSB1細胞增殖能力 將轉染gga-miR-155模擬物、gga-miR-155抑制物以及相應陰性對照的MDCC-MSB1細胞，以2×103·孔-1的細胞數(shù)接種于 96 孔板，每組設 3個重復孔，同時設僅添加細胞培養(yǎng)基的空白對照。分別在培養(yǎng)6、24、48、72、96 h每孔加入20 μL CCK-8，37 ℃ 培養(yǎng)4 h后用酶標儀檢測450 nm處各孔的吸光度(A450nm) 值，利用空白對照組調零去除背景A450nm值，統(tǒng)計分析并繪制細胞生長曲線。

1.2.6 流式細胞術檢測MDCC-MSB1細胞周期 MDCC-MSB1細胞分別轉染gga-miR-155模擬物、gga-miR-155抑制物以及相應陰性對照 48 h后，收集各組細胞，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清；PBS潤洗2次，1 200 r·min-1離心5 min，細胞沉淀用100 μL PBS重懸后，緩慢加入700 μL預冷的80%乙醇，4 ℃固定4 h以上。檢測前于1 200 r·min-1離心5 min，棄去上清，再用預冷PBS潤洗2次，加入100 μL RNase(50 μg·mL-1)，37 ℃孵育30 min；加入400 μL PI (50 μg·mL-1)，4 ℃避光染色30 min；流式細胞儀檢測細胞周期分布。統(tǒng)計分析并繪制細胞各期分布圖。

1.2.7 流式細胞術檢測MDCC-MSB1的凋亡 MDCC-MSB1細胞分別轉染gga-miR-155模擬物、gga-miR-155抑制物以及相應陰性對照 48 h后，收集各組細胞，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清；PBS潤洗2次，1 500 r·min-1離心5 min；按照AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行，先加入500 μL Binding Buffer，重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-APC混勻后，再加入5 μL 7-AAD，混勻；室溫避光反應5～15 min(同時設陰性對照，即正常細胞不加AnnexinV-APC和7-AAD；陽性對照1，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μL AnnexinV-APC單標；陽性對照2，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μL 7-AAD單標)；流式細胞儀檢測。

1.2.8 Transwell檢測MDCC-MSB1細胞的遷移與侵襲 MDCC-MSB1細胞分別轉染gga-miR-155模擬物、gga-miR-155抑制物以及相應陰性對照 48 h后，收集各組細胞，1 000 r·min-1離心5 min，去上清，PBS洗兩次，清洗掉殘余血清；無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，細胞計數(shù)板計數(shù)，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋細胞濃度至6×105cell·mL-1， 備用；在24孔板中預先加入600 μL 10% FBS的1640培養(yǎng)基(含雙抗)，并放入Transwell小室；1 h后在Transwell上室分別接入200 μL各組細胞懸液(侵襲檢測時，在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL終濃度為300 μg·mL-1的Matrigel，待Matrigel干成膠狀后在Transwell上室分別接入200 μL各組細胞懸液)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，下室每孔加入60 μL CCK-8，37 ℃培養(yǎng)4 h；酶標儀測定各孔吸光值A450 nm。

2 結 果

2.1 gga-miR-155模擬物及其抑制物分別上調或下調MDCC-MSB1中gga-miR-155的表達水平

MDCC-MSB1細胞分別轉染 gga-miR-155模擬物、gga-miR-155抑制物及相應陰性對照 48 h，實時熒光定量PCR檢測gga-miR-155在MDCC-MSB1細胞中的相對表達水平。結果顯示，轉染模擬物組gga-miR-155的表達水平極顯著高于模擬物陰性對照組(P<0.01)，轉染抑制物組gga-miR-155的表達水平極顯著低于抑制物陰性對照組(P<0.01，圖1)。

2.2 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞增殖的影響

MDCC-MSB1細胞轉染gga-miR-155模擬物、抑制物及其相應陰性對照后，采用CCK-8法檢測各組細胞增殖能力的變化。結果顯示，在轉染后48、72和96 h，與各自陰性對照組相比，gga-miR-155模擬物轉染組MDCC-MSB1細胞增殖水平顯著增強， gga-miR-155抑制物轉染組MDCC-MSB1細胞增殖水平顯著下降(P<0.05，圖2)。

2.3 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞周期的影響

MDCC-MSB1細胞轉染gga-miR-155模擬物、抑制物及其相應陰性對照后，采用流式細胞術檢測各組細胞周期的變化。結果(圖3)顯示，gga-miR-155模擬物轉染組較其陰性對照轉染組MDCC-MSB1細胞的G1期細胞分布減少，S 期和G2期細胞增加，gga-miR-155抑制物轉染組較其陰性對照轉染組MDCC-MSB1細胞的G1期細胞分布增加，S 期和G2期減少，差異顯著(P<0.05)。

**.P<0.01
圖1 實時熒光定量PCR檢測gga-miR-155在MDCC-MSB1細胞中的表達
Fig.1 The expression of gga-miR-155 in MDCC-MSB1 cells by Real-time quantitative PCR

*. P<0.05
圖2 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞增殖的影響
Fig.2 Effects of gga-miR-155 on the proliferation of MDCC-MSB1 cells

A. gga-miR-155模擬物組；B.gga-miR-155模擬物陰性對照組；C. gga-miR-155模擬物及其陰性對照數(shù)值統(tǒng)計(*. P<0.05)；D. gga-miR-155抑制物組；E.gga-miR-155抑制物陰性對照組；F. gga-miR-155抑制物及其陰性對照數(shù)值統(tǒng)計(*. P<0.05)
A.gga-miR-155 mimic group; B.gga-miR-155 mimic NC group; C. The numerical statistics of the gga-miR-155 mimic and its negative control (*. P<0.05); D. gga-miR-155 inhibitor group; E. gga-miR-155 inhibitor NC group; F. The numerical statistics of the gga-miR-155 inhibitor and its negative control (*. P<0.05)
圖3 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞周期的影響
Fig.3 Effects of gga-miR-155 on the cell cycle of MDCC-MSB1 cells

2.4 gga-miR-155對細胞凋亡的影響

MDCC-MSB1細胞轉染gga-miR-155模擬物、抑制物及其相應陰性對照后，采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡的變化。結果(圖4)顯示，gga-miR-155模擬物轉染組較其陰性對照轉染組MDCC-MSB1細胞的凋亡細胞比例顯著減少(P<0.05)，gga-miR-155抑制物對照組較其陰性對照組的凋亡細胞比例極顯著增加(P<0.01)。

A. gga-miR-155模擬物組；B.gga-miR-155模擬物陰性對照組；C. gga-miR-155模擬物及其陰性對照數(shù)值統(tǒng)計(*. P<0.05; **. P<0.01)；D. gga-miR-155抑制物組；E.gga-miR-155抑制物陰性對照組；F. gga-miR-155抑制物及其陰性對照數(shù)值統(tǒng)計(*. P<0.05; **.P<0.01)
A.gga-miR-155 mimic group; B.gga-miR-155 mimic NC group; C. The numerical statistics of the gga-miR-155 mimic and its negative control (*. P<0.05; **. P<0.01); D. gga-miR-155 inhibitor group; E. gga-miR-155 inhibitor NC group; F. The numerical statistics of the gga-miR-155 inhibitor and its negative control (*. P<0.05; **. P<0.01)
圖4 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞凋亡的影響
Fig.4 Effects of gga-miR-155 on the apoptosis of MDCC-MSB1 cells

2.5 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞遷移的影響

MDCC-MSB1細胞轉染gga-miR-155模擬物、抑制物及其相應陰性對照后，采用Transwell檢測各組細胞遷移能力的變化。結果顯示，gga-miR-155模擬物轉染組MDCC-MSB1細胞的遷移能力比其陰性對照組有所增加，但差異不顯著(P>0.05)，gga-miR-155抑制物轉染組MDCC-MSB1細胞的遷移能力顯著低于其陰性對照組(P<0.05，圖5)。

*. P<0.05
圖5 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞遷移的影響
Fig.5 Effects of gga-miR-155 on the migrate of MDCC-MSB1 cells

2.6 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞侵襲的影響

MDCC-MSB1細胞轉染gga-miR-155模擬物、抑制物及其相應陰性對照后，采用Transwell檢測各組細胞侵襲能力的變化。結果顯示，與各自陰性對照組相比，gga-miR-155模擬物轉染組MDCC-MSB1細胞的侵襲能力顯著增加，gga-miR-155抑制物轉染組MDCC-MSB1細胞的侵襲能力顯著下降(P<0.05，圖6)。

*. P<0.05
圖6 gga-miR-155對MDCC-MSB1細胞侵襲的影響
Fig.6 Effects of gga-miR-155 on the invasion of MDCC-MSB1 cells

3 討 論

MicroRNA(miRNA)是一類長22～25 nt的保守單鏈非編碼小分子RNA，是由具有發(fā)夾結構的初始轉錄本通過Drosha和Dicer兩類RNA內切酶剪切加工形成的。成熟體miRNA 5′ 端的種子序列通過與靶基因的3′ UTR特異性結合而在轉錄后水平調控靶基因的表達。近年來研究表明miRNA已成為一類新型的癌基因或抑癌基因，在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、轉移等多種生物學過程中均發(fā)揮重要的調控作用，它不僅可以通過抑制致癌基因的表達而起到抑制腫瘤的作用，而且它還可以通過減少某些腫瘤抑制基因的表達而促進腫瘤的發(fā)展[4, 17]。因此，miRNAs已可作為癌癥診斷、預后、分級、分期和評判治療效果的分子標志。miR-155是已知miRNA中與腫瘤性疾病最相關的miRNA之一，已證實miRNA-155與許多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關，如在腎癌[18]、神經膠質瘤[19]、肺癌[20]、結腸癌等惡性腫瘤細胞中常呈上調表達，發(fā)揮癌基因的作用。miR-155在腎癌組織中呈高表達，抑制腎癌細胞系中抑制miR-155的表達能抑制腎癌細胞增殖和侵襲、促進腎癌細胞的凋亡，上調靶基因GSK-3β的表達，表明miR-155可通過Wnt/β-catenin通路下調GSK-3β的表達促進在腎癌的發(fā)生[18]。在人非小細胞癌中miR-155呈高表達，miR-155過表達后可靶向抑制PDCD4基因的表達而抑制非小細胞肺癌細胞系的增殖與侵襲[20]。在人神經膠質瘤細胞里miR-155也呈高表達，抑制miR-155的表達可抑制神經膠質瘤細胞的增殖并增強其對替莫唑胺藥物敏感性[21]。由此可見，miRNA-155在腫瘤發(fā)生發(fā)展中“致癌”或“抑癌”作用是通過其表達異常來實現(xiàn)的，如若采取相應的干預手段上調或者下調相應miRNAs的水平，可以達到抑制腫瘤生長的目的。該方面的研究一直是近年來關于miR-155在內的miRNAs作用研究的熱點。在本研究中，熒光定量PCR檢測結果顯示，轉染gga-miR-155模擬物后，MDCC-MSB1細胞中gga-miR-155的表達水平顯著上調，轉染抑制物后gga-miR-155表達水平顯著下調，表明可以采用此干擾手段繼續(xù)進行gga-miR-155的相應功能檢測。在gga-miR-155過表達和抑制表達的基礎上，本研究分別通過CCK-8法檢測細胞增殖、流式細胞術檢測細胞周期和凋亡、Transwell法檢測胞遷移和侵襲。結果顯示，過表達gga-miR-155顯著促進MDCC-MSB1細胞的增殖，G1期細胞分布減少，S 期和G2期細胞增加，細胞凋亡減少，遷移、侵襲能力增加；下調gga-miR-155的表達可顯著抑制MDCC-MSB1細胞的增殖，G1期細胞分布增加，S 期和G2期減少，細胞凋亡增加，遷移、侵襲能力下降。這些結果表明，雖然gga-miR-155在MDV轉化的T淋巴細胞系及MDV感染后的脾腫瘤組織及肝淋巴瘤中均呈下調表達，但其本身可促進MDCC-MSB1細胞增殖、遷移和侵襲，抑制其凋亡。只是在MDV腫瘤形成過程中，gga-miR-155的功能可能被其高表達的功能性同源體MDV-miR-M4代替，但目前還不清楚gga-miR-155呈下調表達的具體機制。Yao等[22]研究發(fā)現(xiàn)網狀內皮組織增生癥病毒(reticuloendotheliosis virus)編碼的致腫瘤蛋白v-rel可改變MDCC-MSB1細胞中gga-miR-155的低表達狀態(tài)，使其異常高表達，且在v-rel誘導雞胚脾細胞的轉化過程中gga-miR-155的表達量異常增加，表明gga-miR-155在腫瘤細胞轉化過程中具有重要的作用，這也驗證了本研究的結果。近年來，其他非編碼RNA，如長鏈非編碼RNA(LncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)與miRNA間相互作用也逐漸被研究者們青睞，而gga-miRNA-155在MD腫瘤細胞或組織中呈下調表達是否也與其他的非編碼RNA的作用有關，還有待進一步的探討。

4 結 論

gga-miR-155可促進MDCC-MSB1細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制其凋亡，其作用機制尚需進一步研究探討。