牦牛鮮精與凍精HSP70表達(dá)差異比較研究

唐 朋，凌笑笑，賈聰俊，梁春年，吳曉云，王宏博，褚 敏，閻 萍*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實驗室，蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，蘭州 730050)

牦牛是青藏高原地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)動物，其提供的肉、奶和毛皮是當(dāng)?shù)啬撩褓囈陨婧桶l(fā)展的生活資料，同時也是牧區(qū)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)和牧民經(jīng)濟(jì)收入的主要來源[1]。但與其它哺乳動物相比，牦牛兩年一胎或三年兩胎的低繁殖率，成為制約高原畜牧業(yè)發(fā)展及生態(tài)保護(hù)的主要瓶頸。人工授精(artificial insemination，AI)是提高牦牛繁殖效率不可或缺的環(huán)節(jié)，這就需要解決精液冷凍保存問題。精液冷凍保存技術(shù)是現(xiàn)代常用的輔助生殖技術(shù)，可長期有效保存優(yōu)質(zhì)種公畜遺傳資源，加快育種進(jìn)程。然而，凍融后精子活力和繁殖力的明顯降低是導(dǎo)致人工授精失敗的根本原因[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在精液冷凍和解凍過程中，精子發(fā)生不可逆的質(zhì)膜破裂、酶(蛋白質(zhì))的變性、脂質(zhì)過氧化作用導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、DNA損傷等致命性損傷，導(dǎo)致至少50%的精子活力降低，甚至死亡，推測這可能與凍融過程中精子蛋白功能的損傷有關(guān)[3-6]。Huang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，凍融后精子活力的維持需要一些蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。因此，分析精子中蛋白質(zhì)的變化可能是預(yù)測精子質(zhì)量的有效方法。

熱休克蛋白(heat shock protein，HSPs)，又稱為熱應(yīng)激蛋白或應(yīng)激蛋白，是細(xì)胞及生物體在理化和生物等應(yīng)激原刺激后，所產(chǎn)生的一類伴隨細(xì)胞內(nèi)功能性伴侶蛋白。作為分子伴侶，HSPs可通過調(diào)控高度特化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。HSPs還具有抗凋亡特性，可以調(diào)節(jié)各種免疫反應(yīng)。因此，HSPs作為潛在的臨床診斷標(biāo)志物是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)[8]。HSP70是HSPs家族最廣泛、最重要的成員，在細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用[9]。HSP70在蛋白質(zhì)折疊和重折疊，識別非天然蛋白質(zhì)構(gòu)象，蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)防止新合成的蛋白質(zhì)聚集，處理受損和錯誤折疊蛋白質(zhì)等方面發(fā)揮重要作用[10-11]。李俊杰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，精子由于應(yīng)激產(chǎn)生HSP70，增強(qiáng)細(xì)胞對外界損傷的耐受程度，維持細(xì)胞的正常代謝功能，且與哺乳動物精子的生成相關(guān)。敲除HSP70小鼠表現(xiàn)為精母細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，初級精母細(xì)胞形成受阻，細(xì)胞凋亡數(shù)增加等[13]。還有報道認(rèn)為，HSP70可能在人精-卵識別中發(fā)揮重要作用，其蛋白表達(dá)水平與牛、豬的受精率密切相關(guān)[14-16]。雖然有研究表明，凍融精液與鮮精相比，精子受精能力明顯降低[17]，但凍融后牦牛精子質(zhì)量、精子HSP70表達(dá)量變化鮮少報道。因此，本試驗以大通牦牛為研究對象，探究冷凍前后對精子活力、質(zhì)膜完整性的影響；采用qRT-PCR、Western blot和免疫熒光技術(shù)探究冷凍前后精子HSP70表達(dá)量及蛋白分布的變化，為探索HSP70在牦牛精子中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 本試驗所用的牦牛精液均來自青海省大通種牛場繁育研究中心。假陰道法(40 ℃) 采集6頭健康且繁殖能力正常的大通牦牛種公牛的精液。鮮精活力≥ 0.70，凍精活力≥ 0.30，精子密度≥ 1×108·mL-1。

1.1.2 主要試劑 Percoll細(xì)胞分離液、12孔板專用細(xì)胞爬片均購自索萊寶科技有限公司(北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒均購自寶生物公司(大連)，Anti-HSP70(ab2787)抗體、二抗均購自Abcam公司(美國)，RNeasy mini kit購自QIAGEN生物公司(德國)，BIOXcell稀釋液購自IMV(德國卡蘇)生物公司，Western blot和免疫熒光檢測所用的其他試劑均購自碧云天生物公司(南京)。

1.2 鮮精稀釋、凍精解凍及精子純化

1.2.1 稀釋液配置 低溫稀釋液與冷凍稀釋液配置相同，均由1體積BIOXcell稀釋液和4倍體積滅菌雙蒸水組成。

1.2.2 牦牛鮮精采集及稀釋 新鮮精液用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行精液常規(guī)品質(zhì)檢查，將精子活力在70%以上、無異味、色澤正常的精液中緩慢加入2倍體積低溫稀釋液(37 ℃預(yù)熱)，輕輕搖晃，使精液與稀釋液充分接觸，室溫下靜置平衡2 h，放入4 ℃恒溫箱中運(yùn)回實驗室備用。

1.2.3 牦牛精液冷凍與解凍 取對應(yīng)牦牛的精液置于試管中，室溫下800 r·min-1低速離心10 min， 棄上清，沉淀用冷凍稀釋液1∶2稀釋，并分裝于0.25 mL的冷凍細(xì)管中，封口機(jī)封口。放入冷凍程序儀中，以3 ℃·min-1速率降至4 ℃，平衡2～3 h， 用液氮熏蒸法處理10 min后，投入液氮中保存。

解凍時，將冷凍細(xì)管從液氮中迅速取出后，立即放到37 ℃水浴鍋中，解凍15 s，待精液完全溶解后，取出細(xì)管，剪開兩端，倒出精液進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2.4 精子純化 取適量新鮮精液和凍融精液分別緩慢加入3倍體積45% Percoll單層梯度液上層，800 r·min-1離心20 min，去上清，向沉淀中加3 mL PBS緩沖液洗滌2次，5 000 r·min-1離心5 min， 留沉淀。

1.3 冷凍前后精子質(zhì)量評定

精子活力：分別取10 μL新鮮精液和凍融精液均勻滴于37 ℃預(yù)熱的載玻片上，蓋上蓋玻片，放在恒溫電子加熱板上1 min左右。在光學(xué)顯微鏡下，取5個不同視野觀察精子運(yùn)動狀態(tài)，對直線運(yùn)動的精子進(jìn)行計數(shù)，計算精子活力。每種處理6個生物學(xué)重復(fù)。

精子質(zhì)膜完整性：采用低滲腫脹-伊紅拒染法(hypoosmotic swelling- excludingeosin Y test，HOS-EY)。將低滲液先置于37 ℃密閉離心管中，加熱5 min， 適量精液與低滲液混合，37 ℃孵育30 min，加入0.05 mL伊紅低滲染料，混勻。在100×相差顯微鏡下觀察300個精子形態(tài)和染色情況，質(zhì)膜完整表現(xiàn)為尾部彎曲和頭部未著色，同時計算質(zhì)膜完整率。每種處理6個生物學(xué)重復(fù)。

1.4 冷凍前后牦牛精子HSP70基因表達(dá)檢測

1.4.1 總RNA提取及cDNA合成 取適量純化后精子，參照RNeasy mini kit操作說明進(jìn)行總RNA提取。用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度，選擇OD260nm/OD280nm為1.8～2.1的總RNA樣品，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將500 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為等濃度cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 qRT-PCR 利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank公布的牛HSP70(登錄號：NM_203322)和β-actin(登錄號：NM_173979)基因序列設(shè)計特異性引物(表1)，引物由北京擎科生物技術(shù)股份有限公司合成。按照熒光定量試劑盒建議的體系進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：SYBR GreenⅠPremix Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，加RNase-free ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)程序采用兩步法：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s， 60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。

表1引物序列

Table1Theprimersequences

基因Gene引物序列(5′→3′)The sequences of primer產(chǎn)物長度/bp Product lengthHSP70F: TGTCGCTGGGACTGGAGA,R: GCTGGTTGTCCGAGTAGGTG111β-actinF: ATTGCCGATGGTGATGAC,R: ACGGAGCGTGGCTACAG177

1.5 Western blot檢測冷凍前后牦牛精子HSP70蛋白

適量鮮精和凍精純化后，加入裂解液和PMSF，置于冰上裂解30 min，超聲波破碎，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，保留上清蛋白溶液。BCA蛋白濃度測定試劑盒定量總蛋白質(zhì)濃度，分裝,置于-20 ℃ 冰箱保存。采用常規(guī)Western blot方法測定提取蛋白樣品中HSP70含量水平。取適量蛋白按比例加入5× SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，每孔上樣量為20 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜及封閉后(5% BSA，37 ℃2.5 h)，分別加入HSP70和α-tubulin一抗，4 ℃孵育過夜。PBS搖床洗膜3次，加入HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1.5 h， PBS洗膜3次，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒進(jìn)行曝光拍照，記錄試驗結(jié)果。使用Image J圖像分析軟件掃描測定，重復(fù)3次， 計算每個條帶的總灰度值。HSP70蛋白相對含量=HSP70蛋白灰度值/α-tubulin蛋白灰度值。

1.6 免疫熒光檢測冷凍前后牦牛精子HSP70蛋白

適量牦牛精液純化后，加4%多聚甲醛混勻，固定25 min， 取3 μL均勻鋪至TC處理的蓋玻片上，風(fēng)干后PBS清洗3次，每次10 min；用1% Triton X-100 通透15 min，PBS清洗3次；5% BSA封閉30 min，PBS清洗3次；HSP70一抗(1∶100)37 ℃濕盒中孵育2 h，PBS清洗3次；加入FITC標(biāo)記二抗(1∶100)，暗盒中37 ℃靜置1 h，PBS清洗3次；DAPI染核5 min，PBS洗3次；將蓋玻片轉(zhuǎn)移至載玻片上，甘油封片；熒光顯微鏡下觀察并拍照，每張片子隨機(jī)選取5個視野，使用Image J圖像分析軟件分析每個視野內(nèi)陽性區(qū)域HSP70的光密度值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示，qRT-PCR以β-actin作為內(nèi)參基因，冷凍前后HSP70基因相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法進(jìn)行均一化處理。采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗分析，每個處理6個重復(fù)，差異顯著性水平為P<0.05。GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 冷凍前后精子活力和質(zhì)膜完整性的變化

分別采集6頭牦牛新鮮和凍融精液，分析冷凍前后牦牛精子活力、質(zhì)膜完整率的變化，結(jié)果見圖1和表2。由表2可見，鮮精組精子活力、質(zhì)膜完整率分別為(71.7±1.054)%、(78.4±0.698)%，凍精組精子活力和質(zhì)膜完整率分別為(33.3±0.494)%、(38.2±1.124)%，與鮮精組相比，凍精組精子活力和質(zhì)膜完整率均極顯著降低(P<0.01)。

A.鮮精組；B.凍精組。1.質(zhì)膜完整的精子；2.質(zhì)膜不完整的精子
A. Fresh group；B. Frozen-thawed group. 1.Sperm with integral plasma membrane；2.Sperm with incomplete plasma membrane
圖1 冷凍前后精子質(zhì)膜完整性檢測(100×)
Fig.1 Detection of sperm plasma membrane integrity before and after freezing(100×)

表2冷凍前后精子活力和質(zhì)膜完整性測定(n=6)

Table2Detectionofspermmotilityandplasmamembraneintegritybeforeandafterfreezing(n=6)

組別Group精子活力/%Sperm motility質(zhì)膜完整率/%Plasma membrane integrity rate鮮精組Fresh group71.7±1.054A78.4±0.698A凍精組Frozen-thawed group33.3±0.494B38.2±1.124B

同列上標(biāo)不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)

Means in the same column with different capital letter superscripts differ extremely significantly between groups(P<0.01)

2.2 冷凍前后精子中HSP70 mRNA的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖2)，HSP70在精子冷凍前后均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異。與鮮精相比，凍精HSP70相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

D. 凍精組；X. 鮮精組。組間比較，*. P<0.05。下同
D. Freezing group; X. Fresh group. Comparison between groups, *.P<0.05. The same as follows
圖2 冷凍前后牦牛精子HSP70 mRNA的表達(dá)量
Fig.2 Expression of HSP70 mRNA in yak sperm before and after freezing

2.3 冷凍前后精子中HSP70蛋白的表達(dá)

通過Western blot分析冷凍前后牦牛精子中HSP70蛋白相對表達(dá)量(圖3)結(jié)果可知，冷凍前后精子中HSP70蛋白水平表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄水平較為類似。HSP70蛋白在精子冷凍前后均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異。鮮精中HSP70蛋白表達(dá)量極顯著高于凍精(P<0.01)。

A. Western blot檢測;B. HSP70蛋白相對表達(dá)量。**. P<0.01。下同
A. Western blot detection; B. The relative expression of HSP70 protein.**. P<0.01. The same as follow
圖3 冷凍前后牦牛精子HSP70蛋白相對表達(dá)
Fig.3 Relative expression of HSP70 protein in yak sperm before and after freezing

2.4 冷凍前后精子中HSP70蛋白的表達(dá)與定位

免疫熒光檢測結(jié)果如圖4所示，冷凍前后精子細(xì)胞內(nèi)HSP70蛋白均有不同程度的表達(dá)。在鮮精中，免疫陽性反應(yīng)主要定位于精子頂體區(qū)、頂體赤道段、后頂體區(qū)和精子中段，而凍精HSP70蛋白主要在精子后頂體區(qū)和精子中段表達(dá)。鮮精組HSP70蛋白的平均光密度值極顯著高于凍精(P<0.01)。

A.HSP70蛋白免疫熒光檢測(100×)；B.平均光密度值分析
A. Immunofluorescence detection of HSP70 protein(100×)；B. Average optical density analysis
圖4 冷凍前后牦牛精子HSP70蛋白的表達(dá)
Fig.4 Expression of HSP70 protein in yak sperm before and after freezing

3 討 論

3.1 冷凍前后HSP70表達(dá)變化

HSP70蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，作為分子伴侶，主要參與蛋白質(zhì)折疊，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。研究表明，溫度的變化可能會影響精子質(zhì)量，凍融過程導(dǎo)致40%～50%活精子損失[3,18]。研究發(fā)現(xiàn)，正常精子HSP70表達(dá)水平高于異?；蛩谰覽19]。本研究采用qRT-PCR和Western blot方法確定冷凍前后HSP70表達(dá)量差異，研究結(jié)果顯示，凍融后精子HSP70 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；HSP70蛋白水平極顯著下降(P<0.01)，這種由溫度變化導(dǎo)致的牦牛精子HSP70表達(dá)量下降與先前研究結(jié)果一致[17]，可能由于凍融后死精子數(shù)的增加導(dǎo)致HSP70合成減少；也可能是精子中HSP70被用于合成其它酶類以降低精子在超低溫條件下的損傷。

成熟精子HSP70蛋白亞細(xì)胞定位與其他體細(xì)胞不同，精子處于獲能或頂體反應(yīng)的不同階段，HSP70呈現(xiàn)出一個動態(tài)再分配過程。在誘導(dǎo)獲能期間，HSP70蛋白緩慢沿著精子質(zhì)膜側(cè)向遷移和重排。正常生理狀態(tài)下，處于不同階段的精子細(xì)胞中HSP70蛋白分配至不同部位，但其表達(dá)量不會存在顯著差異[15]。Kamaruddin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，剛射出的精子僅在頂體檢測到HSP70，而經(jīng)獲能和頂體反應(yīng)的精子HSP70被重新分配至赤道段、后頂體區(qū)和精子中段。本研究進(jìn)一步采用免疫熒光對HSP70蛋白表達(dá)定位顯示：鮮精HSP70定位于頂體區(qū)、頂體赤道段、后頂體區(qū)和精子中段；凍精HSP70蛋白主要定位于后頂體區(qū)和精子中段。與鮮精相比，凍精HSP70平均光密度值極顯著減弱(P<0.01)。本試驗結(jié)果與Varghese等[21]的研究結(jié)論相似。推測冷凍前后HSP70蛋白的定位差異可能是導(dǎo)致冷凍精子繁殖力降低的原因。

3.2 冷凍前后精液品質(zhì)評估

目前，用來評估凍融后精子質(zhì)量的參數(shù)有精子活力和質(zhì)膜完整性。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70與脂質(zhì)膜相互作用，推測其參與膜蛋白和跨膜易位蛋白的折疊[22]。本研究通過分析比較鮮精組和凍融組精子質(zhì)膜完整性發(fā)現(xiàn)，凍融后精子質(zhì)膜完整性極顯著下降(P<0.01)，這可能與精子HSP70蛋白降低有關(guān)。線粒體是精子能量的主要來源，凍融后精子活力的下降與線粒體結(jié)構(gòu)損傷及ATP水平降低有關(guān)[23]。而HSPs具有一種內(nèi)在的ATP酶活性，對于體內(nèi)靶蛋白活化是必不可少的[24]。Aboagla等[25]發(fā)現(xiàn)精子膜蛋白在膜的流動性中發(fā)揮重要作用，精子膜蛋白異常折疊導(dǎo)致膜的流動性降低，進(jìn)而影響精子活力。本研究結(jié)果表明，凍融后精子活力極顯著降低(P<0.01)，這與王昕等[26]的研究結(jié)果一致，推測可能與精子HSP70表達(dá)量有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

HSP70 mRNA與蛋白在冷凍前后牦牛精子內(nèi)均有表達(dá)，但表達(dá)量和分布存在差異。其中凍融后HSP70在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分別呈現(xiàn)顯著(P<0.05)和極顯著降低(P<0.01)。免疫熒光結(jié)果顯示，鮮精HSP70主要在頂體區(qū)、頂體赤道段、后頂體區(qū)和精子中段表達(dá)，而凍精HSP70主要定位于后頂體區(qū)和精子中段且平均光密度值極顯著降低(P<0.01)。本研究為探索HSP70在牦牛精子中的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，但其作用機(jī)制有待深入研究。