清開(kāi)靈注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究

云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，云南 曲靖 655000

清開(kāi)靈注射液為八種中藥組成的復(fù)方制劑，呈棕黃色或棕紅色澄明液體，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開(kāi)竅的功能，臨床用于熱病、神昏、中風(fēng)偏癱、神志不清、急性肝炎、上呼吸道感染等，收載在2015年版《中國(guó)藥典》一部。目前標(biāo)準(zhǔn)采用家兔法進(jìn)行熱原檢查[1]，該檢查方法所用家兔的飼養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果受家兔的個(gè)體差異影響較大。而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，為建立該品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀(天大天發(fā)科技有限公司)；ZH-2BLENDER渦式振蕩器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠(chǎng))。

1.2 試劑與藥品 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE，批號(hào)：1607302，湛江博康海洋生物有限公司)；鱟試劑(TAL，批號(hào)1609021、1705041，標(biāo)示靈敏度0.5 EU/mL，湛江安度斯生物科技有限公司；批號(hào)1607270、1708230，湛江博康海洋生物有限公司)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，批號(hào)1607050，湛江博康海洋生物有限公司)；清開(kāi)靈注射液(批號(hào)：170521B2、171031D1、171202A2，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度的復(fù)核試驗(yàn) 根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(λ)，用BET水分別將CSE溶解并制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)濃度平行做4管，同時(shí)用BET水做2支陰性對(duì)照管。按2015年版《中國(guó)藥典》(通則1143)[2-3]對(duì)TAL進(jìn)行標(biāo)示靈敏度復(fù)核，由表1可見(jiàn)，不同廠(chǎng)家鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定。

2.2 內(nèi)毒素限值(L)的計(jì)算 根據(jù)公式L=K/M，注射劑K=5 EU/kg·h。M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，根據(jù)說(shuō)明書(shū)清開(kāi)靈注射液最大劑量為40 mL，中國(guó)人均體重按60 kg計(jì)算，M=40 mL / 60 kg.1 h=0.667 mL/kg·h,則L=7.5 EU/mL。本品的限值設(shè)為每1 mL清開(kāi)靈注射液中含內(nèi)毒素應(yīng)小于7.5 EU。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

2.3 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的確定 根據(jù)公式MVD=CL/λ，C為供試品溶液的濃度，L為供試品溶液的內(nèi)毒素限值，MVD= CL/λ=1.0 mL/mL×7.5 EU/mL / 0.50(EU)=15。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn) 將供試品用BET水分別稀釋?zhuān)瞥桑涸骸?、10、15倍作為供試品系列(NPC)，同時(shí)用上述每一個(gè)濃度的溶液制備成含1 EU/mL(2λ)濃度的內(nèi)毒素溶液，將此系列溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照系列(PPC)。用λ為0.50 EU/mL的2個(gè)廠(chǎng)家的TAL分別與2個(gè)系列溶液反應(yīng)，每一稀釋度作2支。BET水作陰性對(duì)照(NC)，加入2λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照(PC)，從表2可見(jiàn)清開(kāi)靈注射液存在干擾作用，稀釋15倍時(shí)，即不再對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生干擾。見(jiàn)表2、表3。

表2 清開(kāi)靈注射液干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 (批號(hào)1609021，λ=0.5 EU/mL)

表3 清開(kāi)靈注射液干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 (批號(hào)1607270，λ=0.5 EU/mL)

2.5 干擾試驗(yàn) 根據(jù)干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取3批清開(kāi)靈注射液用BET水分別稀釋15倍，用該稀釋液稀釋CSE，配制成細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為1.0、0.5、0.25、0.125 EU/mL的系列溶液及不含供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液。每個(gè)濃度平行測(cè)定4管，分別與TAL反應(yīng)，同時(shí)用供試品溶液和BET水作陰性對(duì)照(Tc)，進(jìn)行干擾試驗(yàn)，當(dāng)Tc為陰性時(shí)，結(jié)果按公式ES=lg-1(∑Xs/4)和Et=lg-1(∑Xt/4)計(jì)算，式中Xs和Xt分別為含和不含清開(kāi)靈注射液系列各反應(yīng)終點(diǎn)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值。ES均在0.5～2λ范圍內(nèi)，并且Et在0.5ES-2ES范圍內(nèi)，說(shuō)明，15倍稀釋后的清開(kāi)靈注射液在此試驗(yàn)條件下，對(duì)TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素之間的凝聚反應(yīng)無(wú)干擾作用，符合《中國(guó)藥典》的判斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，可以確定清開(kāi)靈注射液對(duì)TAL不產(chǎn)生干擾的濃度大于15倍，使用現(xiàn)市售標(biāo)示靈敏度為0.5～0.03 EU/mL的TAL均可對(duì)清開(kāi)靈注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。見(jiàn)表4、表5。

表4 清開(kāi)靈注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果 (批號(hào)1609021，λ=0.5 EU/mL)

表5 清開(kāi)靈注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果 (批號(hào)1607270，λ=0.5 EU/mL)

2.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的驗(yàn)證 取3個(gè)批號(hào)的供試品分別用BET水稀釋15倍，使用λ=0.25 EU/mL的2個(gè)廠(chǎng)家的鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢查，并按要求做陽(yáng)性(PPC、PC)、陰性(NPC、NC)對(duì)照，結(jié)果3批清開(kāi)靈注射液的內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。見(jiàn)表6。

表6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

本研究所有表格中“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。其判斷標(biāo)準(zhǔn)是形成凝膠且倒轉(zhuǎn)180°不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成凝膠不堅(jiān)固、變形并從管壁滑脫者為陰性。

不同批次供試品對(duì)不同廠(chǎng)家的鱟試劑的干擾程度可能存在不同，為了避免因鱟試劑造成的判斷失誤。因此在干擾預(yù)試驗(yàn)中使用了2個(gè)廠(chǎng)家的鱟試劑，對(duì)3 個(gè)批次的清開(kāi)靈注射液進(jìn)行凝膠限度法內(nèi)毒素檢查，結(jié)果顯示2個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn)的鱟試劑檢驗(yàn)結(jié)果相同，同一廠(chǎng)家不同批次的供試品對(duì)鱟試劑的反應(yīng)結(jié)果也無(wú)差異， 因此確定清開(kāi)靈注射液的最大不干擾濃度為稀釋15倍 。

目前《中國(guó)藥典》2015年版并未收錄清開(kāi)靈注射液，也尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。采用傳統(tǒng)的家兔法檢查熱原，成本高、時(shí)間長(zhǎng)、影響因素多、靈敏度低。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法相比于家兔熱原檢查法，具有經(jīng)濟(jì)、快捷、靈敏和易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)，受到了現(xiàn)代藥品檢驗(yàn)技術(shù)的青睞。因此，開(kāi)展清開(kāi)靈注射液內(nèi)毒素檢查法的研究有著重要的實(shí)際意義。

建議 將清開(kāi)靈注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的熱原檢查項(xiàng)改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)，規(guī)定每1 mL清開(kāi)靈注射液中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于7.5EU。