利用立體解剖鏡和掃描電鏡觀察煙粉虱的形態(tài)學(xué)和發(fā)育歷期

李茂業(yè)，蔡春霞，沈祥祥，張瑞平，張宗錦，劉明科，陳德鑫，閆芳芳

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadias)，屬半翅目(Hemiptera)，粉虱科(Aleyrodidae)，是經(jīng)濟作物(煙草、蔬菜等)上一種重要的世界性害蟲[1-2]。其寄主范圍廣泛，為害嚴重，主要表現(xiàn)在3個方面：一是通過取食植物汁液，致使植株衰弱和生理異常[3]；二是分泌蜜露，直接污染植物或降低果實品質(zhì)[4-5]；三是傳播植物多種病毒[6]。2003年，Q型煙粉虱在我國云南被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已分布全國多個地區(qū)，在湖北等省份發(fā)生比例已超過B型[7-9]。近年來，對煙粉虱的研究成為熱點。但煙粉虱成蟲、若蟲和卵個體均較小，在植物葉片上分布不具明顯規(guī)律，不便于連續(xù)觀測其各蟲態(tài)外部形態(tài)特征和發(fā)育歷期[10-11]。目前，雖有不少學(xué)者利用相關(guān)設(shè)備觀察煙粉虱各蟲態(tài)外部形態(tài)特征，但所獲的圖片不勝清晰且不系統(tǒng)，很難準(zhǔn)確反映其形態(tài)特征?，F(xiàn)代體視解剖鏡和掃描電鏡技術(shù)能夠?qū)Σ牧媳砻嫖^(qū)域進行定性定量觀察分析，使我們能夠觀察材料表面的細微形貌及內(nèi)部組織特征，得到許多充滿信息和色彩的清晰圖像[12-13]。

本文利用NK-300體視解破鏡和掃描電鏡清晰記錄了煙粉虱成蟲、若蟲和卵的外部形態(tài)特征和發(fā)育歷期，并分析各發(fā)育階段與其存活率的關(guān)系，為煙粉虱種類的準(zhǔn)確鑒定及深入研究提供直觀的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物與昆蟲：選取盆栽煙草 (NC95) 為煙粉虱供試寄主植物，將煙草播種于苗圃，幼苗生長至大約6葉期時移栽至塑料花盆內(nèi)，用營養(yǎng)土種植，株高達到約15 cm時轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲籠備用。煙粉虱蟲種由青島市中國農(nóng)科院煙草研究所提供，在人工智能氣候室(溫度25±1℃，相對濕度60%-80%，光周期14L:10D) 用盆栽煙草 (NC95) 飼養(yǎng)10代以上，可獲得不同蟲齡煙粉虱。實驗前，用吸蟲器吸取煙粉虱雌蟲和雄蟲各10只并移入上述無蟲煙苗上產(chǎn)卵24 h，從卵開始觀察煙粉虱各蟲態(tài)形態(tài)特征和發(fā)育歷期及成活率。

1.2 方法

1.2.1 煙粉虱成蟲、若蟲和卵發(fā)育的體視解剖鏡觀察

將帶有煙粉虱1齡若蟲的煙草葉片放置在NK-300體視解剖鏡(日本尼康公司)載物臺上，用環(huán)形熒光光源垂直照射葉片，分叉式冷光源從左右側(cè)面照射葉片。先應(yīng)用粗調(diào)焦旋鈕找到煙粉虱蟲體所在位置，再用細調(diào)焦旋鈕使目鏡下煙粉虱蟲體圖像最清晰。用電腦拍照軟件拍下煙粉虱不同蟲態(tài)和蟲齡照片并標(biāo)定，跟蹤觀察每頭煙粉虱各蟲態(tài)形態(tài)和發(fā)育歷期，用軟件窗口測量工具欄上的測量按鈕測量煙粉虱蟲體的長度和寬度，記錄下每個數(shù)據(jù)。將這些蟲態(tài)的體長和體寬數(shù)據(jù)制作成表格并分析。每隔24小時觀察測量并記錄數(shù)據(jù)。如果出現(xiàn)有蟲體連續(xù)3次的測量結(jié)果沒有變化，則視作該蟲體已經(jīng)死亡。在以后的實驗中不需要測量長度和寬度，僅作觀察。

1.2.2 煙粉虱掃描電鏡樣品制備

用剪刀剪下帶有煙粉虱卵、各齡若蟲和成蟲的煙草(NC95)葉片，置于-70℃超低溫冰箱20 min 在冰上用導(dǎo)電膠將各煙粉虱蟲態(tài)樣品粘于掃描電鏡樣品臺上，再置于-70℃超低溫冰箱2 h，然后置于冷凍干燥機冷凍干燥24 h, 再經(jīng)離子濺射法噴金, 在TM-1000 HICHMI型掃描電子顯微鏡下進行觀測、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對煙粉虱成蟲、各齡期若蟲和卵的發(fā)育時間和大小進行分析整理。首先利用DPS 7.05中ANOVA進行方差分析，然后采用Duncan’s multiple range test 法進行均數(shù)顯著性比較[14]。

2 結(jié)果分析

2.1 立體解剖鏡下煙粉虱成蟲、各齡期若蟲和卵的形態(tài)特征

煙粉虱成蟲體黃色且附有蠟粉，翅白色，無斑點 (圖A)。初孵若蟲在葉片上無規(guī)律自由移動一段時間后就會固定下來，取食汁液。2齡若蟲體較透明，腹部左右側(cè)各出現(xiàn)1個黃色班點 (圖D)，3齡時可見紅色復(fù)眼，體周緣開始出現(xiàn)一些褶皺和突出(圖C)，4齡時，褶皺和突出變得明顯，背部棱清晰 (圖B)。若蟲在發(fā)育過程中體型和體色都會隨著若蟲的蛻皮呈周期性變化 (圖B、C、D)。每一齡的若蟲體色呈淡綠色至黃色，前期較淺，后期較深，體形較為扁平，但背部微隆起。卵不規(guī)則散產(chǎn)在葉背面，長梨形，有小柄，與葉面垂直，初產(chǎn)淡黃色，孵化前呈琥珀色 (圖E，F(xiàn))。

A: 煙粉虱成蟲 Adult of Bemisia tabaci;B: 4齡若蟲 4rd instar nymph;C: 3齡若蟲 3rd instar nymph; D: 2齡若蟲 2rd instar nymph; E: 卵塊孵化Egg hatching; F: 卵塊Egg masses. Ad: 成蟲 Adult; Ny: 若蟲 Nymph; Eg: 卵Egg; Ex: 蛻Exuviate; Sh: 殼 Shell. 比例尺Bar=100 μm.
圖1 立體解剖鏡下煙粉虱的形態(tài)特征

2.2 煙粉虱成蟲、各階段若蟲和卵生命參數(shù)

從表1中的數(shù)據(jù)分析可以看出，煙粉虱卵、成蟲和各階段若蟲的體長和體寬間存在著顯著差異 (體長：F5,18=782.138，P<0.001；體寬：F5,18=439.462，P<0.001)。若蟲從1齡期到4齡期，體長和體寬隨齡期的增加而增大。煙粉虱卵、成蟲和各階段若蟲的發(fā)育歷期不同，存在顯著差異(F5,18=938.583，P<0.001)。其中，成蟲的壽命最長；其次為若蟲，若蟲中2齡期完成發(fā)育所需時間最短，4齡期所需時間最長。煙粉虱卵、成蟲和若蟲的發(fā)育過程中存活率存在顯著差異 (表1)。

2.3 掃描電鏡下煙粉虱成蟲、各齡期若蟲和卵的形態(tài)特征

從圖2 可以清晰看到，煙粉虱成蟲后足明顯長于前足和中足 (圖2，B，C，D，E)；若蟲隨蟲齡的增加體長逐漸增加 (圖2，B，C，D，E)、肛門發(fā)育逐漸完善 (圖2，B，E，F(xiàn)，G)。煙粉虱若蟲1齡若蟲體周緣有較多分散的剛毛且長短不齊 (圖3，E)；2齡體周緣剛毛退化，逐漸演變?yōu)槌砻艿木夶X且體表有較多分散的蠟質(zhì)物(圖2，D)；3齡沿體周緣均有緣齒 (圖3，C)；4齡體周緣緣齒明顯減少，只見于胸部邊緣兩側(cè)和尾部 (圖2，A，B)。這種現(xiàn)象表明3齡若蟲緣齒最多，在取食點固定的最穩(wěn)定。煙粉虱卵形如尖辣椒，表面光滑并有蠟粉附于表面，其尾部有卵柄 (圖2，F(xiàn))。

表1 煙粉虱卵、成蟲和各齡若蟲生命參數(shù)表

注：表中給出結(jié)果加減標(biāo)準(zhǔn)偏差；根據(jù)鄧肯式新復(fù)極差檢測法，表中相同小寫字母表示0.05水平上差異不顯著.

A:成蟲adult B: 四齡若4 instar nymph;C: 三齡若蟲3 instar nymph; D: 二齡若蟲2 instar nymph; E: 一齡若蟲1 instar nymph; F: 卵Egg. St: Stem 柄; Se: Setaceous 剛毛; Te: Teeth 緣齒; Wa: Wax 蠟粉; An: Anus 肛門
圖2 掃描電鏡下煙粉虱成蟲、若蟲和卵的形態(tài)特征

3 討論

本實驗利用智能立體解剖鏡和掃描電鏡系統(tǒng)地觀測了煙粉虱各蟲態(tài)形態(tài)特征及發(fā)育歷期，本研究技術(shù)同以往的研究相比，有以下優(yōu)點。首先，這種技術(shù)比較直觀、連續(xù)。其次，利用連續(xù)對焦拍攝和創(chuàng)建對焦合成軟件功能，可以得到充滿信息和色彩清晰的圖像。同時，利用軟件測量工具對樣品進行定性定量分析，可以對供試蟲體長、寬、局部器官進行測量，可獲得精確數(shù)據(jù)以便做進一步數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析。這些技術(shù)不僅可以應(yīng)用于固定昆蟲的發(fā)育觀察，同時也可以應(yīng)用于記錄昆蟲等小型動物和微小型的動態(tài)行為學(xué)研究[12-13]。

煙粉虱生活史各蟲態(tài)存活率順序為成蟲>若蟲>卵。其中，若蟲各發(fā)育階段的存活率隨若蟲齡期的增加而增大。本實驗中，以盆栽煙草為寄主植物，得出了和其它以辣椒、番茄等為寄主植物的試驗相類似的結(jié)果[15]。在相同的環(huán)境條件下，煙粉虱在同種寄主植物上發(fā)育情況和存活率也是相對穩(wěn)定[16]。

昆蟲的外部形態(tài)是鑒定昆蟲種類重要依據(jù)。利用昆蟲外部形態(tài)鑒定昆蟲種類具有的優(yōu)點為昆蟲外部形態(tài)直觀、研究方法中間環(huán)節(jié)少、觀察過程誤差小和鑒定周期短[17]。本研究利用利用智能立體解剖鏡和掃描電鏡系統(tǒng)直觀觀察并拍照了煙粉虱各個蟲態(tài)，同時，精準(zhǔn)測量了其各個蟲態(tài)的體長且鑒定周期短。

本實驗煙粉虱若蟲的大小和其他研究報道有所不同，可能是由于試驗方法和寄主植物的不同，但可明顯看出煙粉虱若蟲在各齡期體長，體寬存在顯著差異，這一點與其他學(xué)者研究報道的相同。若蟲在整個蛻皮過程中，身體特征出現(xiàn)明顯變化，其中包括身體厚度、紅色眼點清晰度以及透明度的變化。從前一齡次蛻皮結(jié)束到下一齡蛻皮開始，身體由薄變厚，體色由透明變渾濁。根據(jù)成蟲、若蟲和卵體態(tài)大小和發(fā)育特點，可以準(zhǔn)確識別煙粉虱種類、各蟲態(tài)和若蟲的齡期。