米糠黃酮的提取及其抗癌活性初步研究

劉劍利 劉 丹 王 帥 唐志鵬 賀 音 曹向宇

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，沈陽 110036)

米糠是稻谷加工的副產(chǎn)品，約占稻谷產(chǎn)量5.0% ～5.5%，年產(chǎn)近 1 000萬 t，是一種產(chǎn)量大、綜合利用價(jià)值不高的農(nóng)副產(chǎn)品［1］。在我國，米糠大部分用于畜禽飼料使用，有效成分利用率不足20%［2］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)米糠中包含豐富的活性成分，包括低過敏性的米糠蛋白［3］;降低人體血清膽固醇的米糠油［4］;增強(qiáng)免疫力的米糠多糖［5］;米糠中含有15% ～23%脂肪、14% ～16%蛋白質(zhì)、25% ～40%膳食纖維，還含有大量γ－谷維素(3.86～5.89 mg/g)、多酚(9.60 ～81.85 mg GAE/g)、維生素 E(0.32 ～0.44 mg/g)等生理活性物質(zhì)［6］。研究表明:米糠中含有花青素、柚皮素和槲皮素等黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的生物活性，如顯著的抗氧化、抗衰老等功能［7］，而關(guān)于米糠黃酮抗肺癌的研究鮮有報(bào)道。開發(fā)和利用米糠黃酮既有利于資源的循環(huán)利用，又能產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)收益，為人類健康和疾病預(yù)防提供一種明確生物活性的天然物質(zhì)。

黃酮類化合物比較常用的制備方法包括有機(jī)溶劑提取、堿性水提、超臨界萃取等，水浸提的弊端在于粗品中含有很多不純成分，得率偏低;堿提浸出效果好，但雜質(zhì)多，給后期純化帶來不便;超臨界CO2萃取技術(shù)具有得率高、無殘留溶劑、無污染的優(yōu)點(diǎn)，但是所需設(shè)備價(jià)格昂貴、生產(chǎn)成本高［8］。目前，米糠黃酮最常用的提取方法為有機(jī)溶劑提取，黃酮提取率不高［9］。因此尋求生產(chǎn)成本較低的、黃酮得率高的方法，對(duì)于黃酮開發(fā)具有重要意義。超聲波法利用超聲波動(dòng)形式破壞組織，促進(jìn)溶劑的穿透作用，提高有效成分的得率［10］。酶解法通過降解植物細(xì)胞壁，促進(jìn)胞內(nèi)有效成分溶出，較溫和的將組織分解，確保提取物的性質(zhì)穩(wěn)定，既能縮短所用時(shí)間，又能提高得率［11］。本研究擬采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助酶法提取米糠黃酮工藝，進(jìn)一步研究米糠黃酮對(duì)人肺癌細(xì)胞(A549)的作用，以期為米糠資源的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，沈星1號(hào):沈陽市北星水稻研究所;人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549:中國醫(yī)科大學(xué)，實(shí)驗(yàn)室液氮保存;蘆丁(純度﹥95%)、纖維素酶(酶活力U/g≥1.5×104)、二甲基亞砜(DMSO):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽(MTT):Sigma公司;RPMI－1640培養(yǎng)基(Hyclone)、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶:北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Hochest33258:南京凱基生物科技。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV－2700紫外分光光度計(jì):島津企業(yè)管理(中國)有限公司;SCIENTZ－IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司;SCIENTZ－10N型真空冷凍干燥機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司;RE－52CS－2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;Multiskan FC型酶標(biāo)儀:賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;HERACELL 150i二氧化碳培養(yǎng)箱:北京昊諾斯科技有限公司;Nikon(MODEL C－SHG1)熒光顯微鏡:尼康儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮得率的測(cè)定

參照關(guān)海寧等［12］方法，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出提取液中黃酮的質(zhì)量濃度，通過公式得出米糠黃酮得率。

式中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出測(cè)定樣液的質(zhì)量濃度/mg/mL;V為測(cè)定吸光度時(shí)樣液的體積/mL;N為提取液總體積/測(cè)定吸光度移取樣液的體積;M為米糠質(zhì)量/mg。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

米糠經(jīng)粉粹機(jī)粉碎，過60目篩制成粉末備用。稱取1 g米糠粉末，置于小燒杯中，固定其他實(shí)驗(yàn)條件(蒸餾水20 mL，水浴溫度50℃，酶解時(shí)間2 h，pH 5)，進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解結(jié)束后，離心取上清，余下沉淀進(jìn)行超聲處理，超聲后離心取上清，合并上清液測(cè)得率。以米糠黃酮的得率為指標(biāo)，分別考察超聲輔助酶法提取米糠黃酮的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、加酶量(60、90、120、150、180 U/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)、超聲時(shí)間(10、20、30、40、50 min)4 個(gè)因素對(duì)米糠黃酮得率的影響，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.3.3 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以米糠黃酮得率為響應(yīng)值，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)米糠黃酮影響顯著的4個(gè)因素，采取4因素3水平的組合設(shè)計(jì)，篩選制備米糠黃酮的最佳工藝條件。

表1 Box－Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平

1.3.4 米糠黃酮抗肺癌活性的測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)條件:A549細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%胎牛血清，1%雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80% ～90% 時(shí)，按照1∶3比例傳代，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中米糠黃酮提取液經(jīng)冷凍干燥后得到粉末，采用A549細(xì)胞的培養(yǎng)基將其溶解，細(xì)胞處理所用黃酮液的添加量為總體積的4.76%，未對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)體系形成實(shí)質(zhì)性改變。

1.3.4.1 米糠黃酮對(duì)A549細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)觀察

A549細(xì)胞以每孔4×105個(gè)接種到6孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液體積2 mL，置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后設(shè)置正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(米糠黃酮質(zhì)量濃度 20、40、80 mg/mL)，共同培養(yǎng) 24 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4.2 米糠黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖情況影響

A549細(xì)胞以每孔3×103個(gè)接種到96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液體積200μL，細(xì)胞培養(yǎng)方法及各劑量組濃度同 1.3.4.1，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.4.3 米糠黃酮對(duì)A549細(xì)胞凋亡水平影響

處理好的蓋玻片置于12孔板中，將A549細(xì)胞以每孔8×104個(gè)接種到12孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液體積1 mL，細(xì)胞培養(yǎng)方法及各劑量組濃度同 1.3.4.1，24 h后去除培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min后，去固定液并清洗，向蓋玻片上滴加100μL Hoechst33258工作液，染色后于熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算凋亡率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，比較組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖1所示，黃酮含量與其在510 nm處的吸光度值呈良好的相關(guān)性，其中R2=0.999 2，根據(jù)公式y(tǒng)=10.97x+0.058 2可計(jì)算出提取液中黃酮含量。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)圖2可知，料液比在1∶10～1∶20 g/mL的范圍內(nèi)，米糠黃酮的得率呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時(shí)，米糠黃酮得率最高，當(dāng)料液比比值持續(xù)變大時(shí)，米糠黃酮的得率逐漸減小。這可能是因?yàn)橐毫媳葹?∶20 g/mL時(shí)，黃酮類物質(zhì)已基本溶出，繼續(xù)增加溶劑用量反而會(huì)促使其他雜質(zhì)的溶出，使得黃酮得率下降［13］。考慮到節(jié)約成本以及后續(xù)回收操作，因此選擇1∶20為最佳料液比。加酶量在60～180 U/g的區(qū)間內(nèi)，米糠黃酮的得率呈現(xiàn)先上升后平緩趨勢(shì)，在120 U/g時(shí)，得率最高;繼續(xù)增大加酶量，黃酮得率變化不大。原因是加酶量不足導(dǎo)致細(xì)胞壁沒有充分溶解，細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)釋放不完全，導(dǎo)致得率低。當(dāng)加酶量足夠時(shí)，細(xì)胞壁被充分降解，黃酮從細(xì)胞中被釋放出來，提高得率。但當(dāng)加酶量繼續(xù)增大時(shí)，米糠黃酮的得率沒有繼續(xù)上升，原因可能是溶液中的酶添加量已接近飽和，繼續(xù)增加酶用量，對(duì)得率作用不大。從降低成本、節(jié)約能源角度考慮，加酶量為120 U/g時(shí)最佳。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 不同因素對(duì)米糠黃酮得率的影響

如圖2所示，一定范圍內(nèi)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)持續(xù)提高，米糠黃酮的得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，得率最高。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)由60%不斷加大到80%，米糠黃酮的得率不斷減小。這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)變大，會(huì)增加其他醇溶性物質(zhì)的溶出量，使黃酮類物質(zhì)的得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)［13］。綜合來看，乙醇體積分?jǐn)?shù)控制在60%左右為宜。超聲時(shí)間在10～20 min的范圍內(nèi)，米糠黃酮的得率逐漸提高，在超聲時(shí)間到達(dá)20 min時(shí)，米糠黃酮得率最高。但當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)提高，米糠黃酮的得率呈現(xiàn)減小趨勢(shì)。可能是由于超聲過程中機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)不斷上升，對(duì)黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生破壞。由此可知20 min為最佳超聲時(shí)間。

采用 Design－Expert 7.0軟件中的 Box－Behnken程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果見表2，根據(jù)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出以米糠黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程為:

表2 Box－Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.4 回歸模型方差分析

由表3 可知，一次項(xiàng) A、B、C、D 和二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對(duì)米糠黃酮得率的作用均達(dá)到了極顯著水平;模型(P＜0.000 1)極顯著，失擬項(xiàng)(P=0.054 8＞0.05)不顯著，說明模型成立。方程相關(guān)系數(shù)R2=0.969 7，校準(zhǔn)決定系數(shù) R2Adj=0.939 4，變異系數(shù)CV%=1.2，說明模型與實(shí)際擬合程度好，能較好地反映米糠黃酮得率與各因素之間的關(guān)系，由影響因素的F值可以判斷各因素對(duì)得率的影響順序?yàn)?B＞A＞C＞D。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析

2.5 雙因素交互作用分析

通過Box－Behnken實(shí)驗(yàn)得出各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)米糠黃酮得率變化的交互作用，確定各因素的最優(yōu)影響范圍。料液比在1∶18～20 g/mL范圍，酶用量在120～126 U/g范圍，乙醇體積分?jǐn)?shù)在59% ～61%之間，最適的超聲時(shí)間在18～20 min之間對(duì)黃酮得率最佳。其中，影響米糠黃酮得率最顯著的因素為加酶量，其他因素次之，各項(xiàng)單因素對(duì)應(yīng)的P值均小于0.01，皆達(dá)到極顯著水平。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design－Expert 7.0軟件得到預(yù)測(cè)的米糠黃酮最佳提取工藝為:料液比1∶18.82 g/mL、酶用量124.69 U/g、乙醇體積分?jǐn)?shù) 60.49%、超聲時(shí)間 18.97 min，在此條件下黃酮的理論得率為0.524%。考慮到實(shí)際操作中遇到問題，將此工藝修整為:料液比1∶19 g/mL、酶活力125 U/g、乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%、超聲時(shí)間19 min，并進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出黃酮得率為0.52%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，說明模型能較好預(yù)測(cè)米糠中黃酮得率，優(yōu)化工藝條件較可靠。

2.7 米糠黃酮對(duì)人肺癌細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

從圖3可以看出，對(duì)照組細(xì)胞形狀勻稱，貼壁較好，棱角清晰。隨著米糠黃酮濃度的增加，細(xì)胞貼壁數(shù)目逐漸減少，邊緣模糊，折光性減弱，其中80 mg/mL米糠黃酮組細(xì)胞明顯變圓收縮，凋亡特征明顯，說明米糠黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有抑制作用，并且呈現(xiàn)量效關(guān)系。劉盛楠等［14］選取白藜蘆醇誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖3 米糠黃酮對(duì)A549貼壁細(xì)胞數(shù)的影響(100×)

2.8 米糠黃酮對(duì)人肺癌細(xì)胞增值情況的影響

由圖4所示，米糠黃酮能夠有效抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且隨米糠黃酮?jiǎng)┝康纳?，?duì)細(xì)胞抑制效果增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度上升到80 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率變?yōu)?42.6±0.13)%，與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01)，對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯。李富華等［15］實(shí)驗(yàn)表明苦蕎麩皮黃酮在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，能顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖且表現(xiàn)出量效關(guān)系，與米糠黃酮效果類似。

圖4 米糠黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.9 米糠黃酮對(duì)A549細(xì)胞的Hoechst33258實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Hoechst33258是一種熒光藍(lán)色染料，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過Hoechst33258染料檢測(cè)不同濃度的米糠黃酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的能力。對(duì)照組細(xì)胞顯現(xiàn)均勻且較弱的藍(lán)色熒光，與對(duì)照組相比，當(dāng)米糠黃酮處理組濃度提高時(shí)，細(xì)胞核皺縮的數(shù)量上升，出現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光斑塊，即凋亡細(xì)胞數(shù)量上升，與對(duì)照組比較，差異極顯著;而且隨著米糠黃酮處理濃度的升高，細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，與對(duì)照組比較，差異極顯著(P＜0.01)。結(jié)果表明，米糠黃酮可以有效的誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡。鐘良瑞等［16］實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)三葉青黃酮處理的A549細(xì)胞通過Hoechst 33258染色后細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核顏色變亮，出現(xiàn)增強(qiáng)的藍(lán)色熒光，與米糠黃酮效果相近。

圖5 熒光顯微鏡下觀察A549細(xì)胞Hoechst33258實(shí)驗(yàn)結(jié)果(200×)

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)影響米糠黃酮制備的4個(gè)因素進(jìn)行探究，得出提取的最佳工藝條件為:料液比1∶19 g/mL、加酶量125 U/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間19 min，得出米糠黃酮得率為0.52%。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT細(xì)胞活力檢測(cè)及Hoechst33258細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)均顯示米糠黃酮對(duì)A549細(xì)胞具有一定的生長(zhǎng)抑制作用，說明制備的米糠黃酮具有一定抗癌活性，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。