荷移光度法測定谷物中嘌呤含量的實驗

劉曉庚 劉季敏 何詩雨 曹崇江 劉 琴周 彤 楊曉童 謝忠良 劉崇靖 汪若瑾

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心;江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

研究表明痛風(fēng)及高尿酸血癥與飲食關(guān)系非常密切，且近年來這類患者逐年增加［1］;另外，通過限制富含嘌呤食物的攝入來預(yù)防痛風(fēng)有良好效果［2－3］。在全球飲食結(jié)構(gòu)不斷變革的今天，人們對膳食營養(yǎng)的需求也隨之改變，一些傳統(tǒng)的不良飲食習(xí)慣都在影響著人們的健康。目前有關(guān)食品中嘌呤含量的測定方法主要有紫外－可見光譜法［4］、紅外光 譜 法［5］、熒 光 光 譜 法［6－8］、高 效 液 相 色 譜法［9－12］、質(zhì)譜法［13－14］、毛細(xì)管電泳法［15－19］和電化學(xué)法［20－21］等，而國內(nèi)鮮見統(tǒng)一的食品中嘌呤含量測定方法［22］，因而無法在膳食方面提供有效的科學(xué)指導(dǎo)［23］。針對現(xiàn)階段最公認(rèn)的嘌呤測定方法——HPLC法存在著操作過程比較繁瑣，使用試劑多，且有些還有毒或有害，對環(huán)境有污染等不足之處［24］;其他方法有的操作繁雜成本高、有的穩(wěn)定性差達(dá)不到測定要求、有的適用范圍狹窄等。為此，在已探討的荷移光度法［25－29］的基礎(chǔ)上，用荷移光度法測定谷物中嘌呤化合物含量，旨在尋得一種綠色無污染、操作簡便、測定速度快又準(zhǔn)確的谷物嘌呤測定新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

玉米、小麥、稻米(秈米、粳米、糙米)、稻殼、米糠、大豆均由江蘇省糧食局糧油質(zhì)量監(jiān)測所提供，小米、馬鈴薯、綠豆購自蘇果超市當(dāng)年產(chǎn)無病害商品。

鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、四氯對苯醌、氯醌酸、二甲亞砜(DMSO)，所用試劑均為分析純。

1.1.2 設(shè)備與儀器

Allegra 64R離心機(Beckman Coulter);RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;KH－300DE型超聲波清洗器;UV－8000A型雙光束紫外/可見分光光度計;agilent1260高效液相色譜。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤分別用少量0.1 mol/L NaOH+水溶解后再用無水乙醇配成為1.00× 10－2mol·L－1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再逐級稀釋成1.00 ×10－4mol·L－1標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，備用。

1.2.2 樣品處理

按文獻(xiàn)［12］方法并作修改后對試樣處理，具體為:稱取2 g無病害干凈鮮樣品或0.4 g干樣品(均精確至0.1 mg)于研缽中，研碎后定量轉(zhuǎn)移至燒瓶中，加入10 mL 70%高氯酸，在沸水浴中進(jìn)行回流水解45 min，冷卻后，用7 mol/L KOH中和至pH 7抽濾，濾液用1 mol/L磷酸調(diào)pH至3，再于3 500～4 000 r/min下離心15 min。清液于沸水浴上減壓旋蒸至干，再用無水乙醇超聲洗滌提取物4～5次，收集洗滌液以無水乙醇定容至50.0 mL，依次經(jīng)G5砂芯漏斗和0.22μm膜過濾，將待測試液于0～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 測定操作

取1.00 mL樣液于10 mL容量瓶中，加入1.00 mL 1 ×10－3mol·L－1氯醌酸乙醇液，搖勻，用無水乙醇定容，在一定溫度下反應(yīng)一段時間后，再用1.0 cm的石英比色皿以試劑空白為參比，測得532 nm處吸光度值(ΔA)。

1.2.4 測定條件優(yōu)化

用單因素考察法優(yōu)化荷移劑種類、測定介質(zhì)、酸度、荷移反應(yīng)溫度、荷移反應(yīng)時間和反應(yīng)物配比。然后，與現(xiàn)行的HPLC法［11］進(jìn)行對比。HPLC條件為色譜柱:Agilent XDB－C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm);流動相:水－甲醇－冰乙酸－10%四丁基氫氧化銨(879/100/15/6);柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10.0μL;檢測波長:254 nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010繪圖。Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計實驗的多元回歸分析及方差分析均用Design－ Expert 8.0.6軟件處理。其他數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析與處理，結(jié)果以“平均值±SD”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 荷移劑的選擇

在相同濃度下分別以氯醌酸、四氯對苯醌、茜素、茜素紅、苦味酸、對苯醌、2，4－二硝基苯酚和TCNQ(2，5－環(huán)己二烯－1a，4a－雙丙二腈或四氰代苯醌二甲叉)為荷移劑與鳥嘌呤按1.2.3操作方法進(jìn)行反應(yīng)，測得其反應(yīng)后的UV－VIS(紫外可見光)吸收曲線(見圖1)。由圖1可知氯醌酸的荷移反應(yīng)產(chǎn)物的UV－VIS吸收曲線最為理想，吸收曲線的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均佳且λmax均為532 nm，為此選擇氯醌酸為荷移劑。為了求得嘌呤與氯醌酸荷移反應(yīng)的關(guān)系，進(jìn)一步實驗了四種嘌呤及其混合物分別與氯醌酸反應(yīng)后UV－VIS吸收曲線(見圖2)。從圖2可見，這幾種嘌呤及其混合物均能與氯醌酸發(fā)生荷移反應(yīng)形成良好的UV－VIS吸收曲線，盡管單獨嘌呤的荷移吸收峰位置和吸收強度稍有差異，但是它們的混合物表現(xiàn)出了極好的吸收曲線，而且混合物吸收峰與鳥嘌呤的峰存在極佳的相關(guān)性，這為用氯醌酸荷移光度法測定嘌呤奠定了客觀基礎(chǔ)。故選擇氯醌酸為荷移劑，且通過以鳥嘌呤為代表來考察并確定有關(guān)荷移光度法的測定條件。

圖1 不同荷移劑與鳥嘌呤反應(yīng)的吸收光譜

圖2 四種嘌呤及其混合物與氯醌酸反應(yīng)的吸收曲線

2.2 測定介質(zhì)的確定

荷移反應(yīng)的介質(zhì)一般選用非水介質(zhì)，故分別對常用無水乙醇、甲醇、乙腈作為介質(zhì)按照實驗1.2.3操作方法，在其他條件不變，測定其吸收曲線(見圖3)。由圖3可知，以無水乙醇作為介質(zhì)最佳，所以后續(xù)實驗選用無水乙醇作為測定介質(zhì)。

圖3 不同介質(zhì)的影響

2.3 水分的影響

在其他條件不變下，調(diào)節(jié)體系的水分含量分別為 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%按照實驗1.2.3操作方法，測得其吸收曲線(見圖4)。由圖4可知，體系水分在3.0%以內(nèi)的ΔA532值基本恒定，所以測定中控制水分2.5%～3.0%。

圖4 反應(yīng)體系水分量的影響

2.4 酸度及酸度調(diào)節(jié)劑的影響

按1.2.3操作方法，在其他條件不變，分別用磷酸、鹽酸和硝酸將體系pH均調(diào)至5～6，測得其吸收曲線(見圖5)。由圖5及實驗現(xiàn)象表明，加硝酸或鹽酸后，體系顏色由紫紅色變?yōu)榱藴\黃色，UV－VIS曲線在可見光區(qū)也無吸收峰，這可能是硝酸的氧化性及氮和氯的供電子作用所致，因此，不宜用硝酸或鹽酸調(diào)節(jié)酸度。故選擇磷酸為酸度調(diào)節(jié)劑。

在其他條件不變，按1.2.3操作方法分別用磷酸將pH調(diào)至5.0、6.0和用氫氧化鈉將pH調(diào)至8.0、9.0后分別測定其吸收曲線(見圖6)。由圖6可知，當(dāng)pH＞7呈堿性時吸收峰消失，荷移反應(yīng)受－OH的供電子作用而被完全破壞;而pH 5～6時吸收曲線差別較小且峰值大，pH 7(中性)時吸收曲線形狀有所改變但吸收峰值與pH 5～6時相一致?？梢妼嶒炛幸部刹活~外加酸度調(diào)節(jié)劑，即在中性條件下直接測定即可。

圖5 不同酸度調(diào)節(jié)劑的影響

圖6 不同酸度(pH值)的影響

2.5 反應(yīng)溫度的影響

在其他條件不變，按1.2.3操作方法，分別在10℃、20℃、30℃、40℃水浴中保溫反應(yīng)20 min后，再在室溫下測得吸收曲線(見圖7)。從圖7可見，溫度對其荷移反應(yīng)影響甚小，吸收曲線形狀幾乎不變，這也表明在此溫度范圍內(nèi)該荷移反應(yīng)機理相同;但升溫對ΔA532值略有增加且低溫增幅比高溫大得多，這可認(rèn)為該反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，且吸熱會隨溫度升高而略微增加。為方便操作故后續(xù)實驗選擇室溫(約25℃)下進(jìn)行。

圖7 不同溫度的影響

圖8 不同反應(yīng)時間的影響

2.6 反應(yīng)時間的影響

在其他條件不變，按1.2.3操作方法，分別測定反應(yīng)5、10、20、30、40、50 min 和1、2、3、6、20 h 時的吸收曲線(見圖8)。由圖8可知，反應(yīng)時間從5～30 min內(nèi)其ΔA532值和吸收曲線都幾乎不變，在3 h以前吸收曲線形狀無明顯變化;6 h和20 h的吸收曲線形狀呈現(xiàn)出無規(guī)律的變化，溶液顏色逐漸消失，20 h時顏色完全消失。在450 nm后也無吸收峰，但在360～450 nm呈現(xiàn)雜亂的吸收，這反映出該荷移絡(luò)合物的不穩(wěn)定性和20 h時這種絡(luò)合物已完全解離。這樣的變化不會影響該方法用于分析測定的可行性，因為它給測定留出了足夠的穩(wěn)定時間。因此，以選擇反應(yīng)時間為5～30 min為宜，本實驗選用反應(yīng)時間為8 min。

2.7 反應(yīng)的化學(xué)計量確定

由于荷移反應(yīng)是一步完成的反應(yīng)，適合用平衡移動法［25］確定所形成絡(luò)合物的組成。因此在其他條件不變，按1.2.3操作方法只改變氯醌酸的用量進(jìn)行測定，其結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，吸光度隨氯醌酸用量的增加而升高，只是在達(dá)到穩(wěn)定計量點前較計量點后稍許顯著升高。當(dāng)氯醌酸用量與鳥嘌呤用量摩爾比達(dá)到1∶3時，特征吸收峰最為完美，且吸光度最大。故認(rèn)為氯醌酸與鳥嘌呤能形成摩爾比1∶3的穩(wěn)定絡(luò)合物。

圖9 氯醌酸與鳥嘌呤反應(yīng)配比的影響

2.8 荷移反應(yīng)的機理推測及反應(yīng)的絡(luò)合常數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)自由能

2.8.1 荷移反應(yīng)的機理推測及反應(yīng)模型

根據(jù)荷移反應(yīng)的構(gòu)效關(guān)系［8］可知，氯醌酸為平面型π電子接受體，而嘌呤分子中均有孤電子對可作為電子給予體，在乙醇溶液中鳥嘌呤分子與氯醌酸可形成n－π*或π－π*型類似夾心面包式荷移絡(luò)合物。基于測得其荷移絡(luò)合物組成配比為n氯醌酸∶n鳥嘌呤=1∶3，其荷移反應(yīng)可表示為:

2.8.2 絡(luò)合常數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)自由能

2.9 實際樣品的測定及其效果

2.9.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取鳥嘌呤和混合總嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，按 1.2.3 測定操作方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，結(jié)果顯示鳥嘌呤和混合總嘌呤的濃度在0～1×10－4mol·L－1范圍內(nèi)有良好線性 關(guān) 系，且 其 線 性 方 程 分 別 為 ΔA鳥嘌呤=0.034c鳥嘌呤+0.005(R2=0.995 2)、ΔA總嘌呤=0.028 5c總嘌呤+0.007 1(R2=0.992)，其摩爾吸光系數(shù)分別為 ε鳥嘌呤=3.1 ×104L·mol－1·cm－1(這一結(jié)果與用Benesi－Hildebrand方程求算的結(jié)果相同，從另一個側(cè)面佐證了測定方法的可靠性)、ε總嘌呤=3.6×104L·mol－1·cm－1;其檢出限按信噪比 S/N=3［11］算得相對應(yīng)的嘌呤濃度分別為 2×10－6mol·L－1、9×10－6mol·L－1。

2.9.2 實際樣品的測定與效果分析

按1.2.2的方法，先將試樣進(jìn)行嘌呤提取，再將制得的嘌呤按1.2.3方法分別對實際樣品測得其ΔA532值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線算得原樣中嘌呤含量，結(jié)果見表1。

表1 谷物及其制品中嘌呤含量測定結(jié)果(n=5)

從表1可知，實驗建立的方法有良好的精密度，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于8%。其中鳥嘌呤的RSD比總嘌呤的略大，原因是鳥嘌呤含量較低所致;另外，本法和HPLC法的RSD分別為2.2% ～7.3%、2.2%～7.5%，可見本法的精密度與HPLC法一致，這是兩種方法測定的穩(wěn)定性相當(dāng)且都有較高的結(jié)果。本法的回收率為 83.8% ～98.1% (平均91.9%)，與曲欣等［11］用 HPLC 法回收率達(dá) 91.8%相一致，符合微量組分分析要求。同時，經(jīng)F－檢驗和t－檢驗也都表明本法與HPLC法無統(tǒng)計學(xué)上差異(P=0.05)。顯然本法利用氯醌酸與嘌呤的荷移反應(yīng)光度的方法測定谷物中的嘌呤含量其精密度和準(zhǔn)確性均與HPLC法相當(dāng)，這也表明氯醌酸荷移光度法測定谷物中的嘌呤含量可行。

3 結(jié)論

以氯醌酸為荷移劑的光度法測定嘌呤含量的實驗得到其最優(yōu)反應(yīng)條件為:室溫(20～30℃)、pH中性、以無水乙醇為介質(zhì)、控制測定體系水分2.5% ～3.0%、反應(yīng)5 ～30 min，能得到 n氯醌酸∶n鳥嘌呤=1 ∶3的紫紅色穩(wěn)定荷移絡(luò)合物;在λmax=532 nm下，鳥嘌呤和混合總嘌呤的濃度在0～1×10－4mol·L－1范圍內(nèi)符合朗伯－比耳定律且有良好的線性關(guān)系，其線性方程分別為 ΔA鳥嘌呤=0.034c鳥嘌呤+0.005(R2=0.995 2)、ΔA總嘌呤=0.028 5c總嘌呤+0.007 1(R2=0.992)，其摩爾吸光系數(shù)分別為ε鳥嘌呤=3.1×104L·mol－1·cm－1、ε總嘌呤=3.6 ×104L·mol－1·cm－1，檢出限分別為 2 ×10－6mol·L－1、9 ×10－6mol·L－1。而對谷物實樣的測得結(jié)果顯示本實驗所建立方法有良好的精密度(RSD2.2% ～7.3%)且與HPLC法(RSD2.2% ～7.5%)相一致，回收率為83.8% ～98.1%與 HPLC法≥91.8%相當(dāng)，符合 GB/T 27417—2017對微量成分分析的要求，獲得了滿意的結(jié)果。可見氯醌酸荷移光度法測定谷物中的嘌呤含量可行，而且本法易操作、速度快、成本低，是一種具有發(fā)展前景的測定食品嘌呤的方法。