不同水分活度下稻谷和糙米黃曲霉毒素累積風(fēng)險(xiǎn)的比較

李凱龍 田 芳 王達(dá)能 鄧樹華 陳 甜 吳樹會(huì) 周劍宇

(湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心1，長(zhǎng)沙 410201)

(郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心2，郴州 410201)

谷物是全世界范圍內(nèi)最重要的主食之一，其中88%的消費(fèi)量和77%的出口集中在亞洲地區(qū)。根據(jù)2016年國(guó)際糧農(nóng)組織(FAO)的統(tǒng)計(jì)，近年來谷物產(chǎn)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，糙米產(chǎn)量也突破了49 520萬t［1］。因亞熱帶－熱帶地區(qū)適宜的溫濕度條件有利于真菌生長(zhǎng)和真菌毒素的污染，使得亞洲地區(qū)谷物真菌毒素安全尤為突出。黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，在糧食和食品中的主要存在形式包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1及 M2等，其中 AFB1的毒性和致癌性最強(qiáng)［2］。所以許多國(guó)家和組織制定了食品和飼料中AFB1的最高限量，歐盟規(guī)定谷物中AFB1的含量不能超過2 μg/kg，AFs的總量不得超過 4 μg/kg［3］，我國(guó)最新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017中規(guī)定玉米及其制品中AFB1的限量為20μg/kg，稻谷、糙米和大米中AFB1的限量為10μg/kg，小麥、大麥及其他谷物中AFB1的限量為5μg/kg。隨著谷物消耗量的不斷增加，即使是低劑量AFs的潛在污染都會(huì)對(duì)消費(fèi)者造成風(fēng)險(xiǎn)。從田間到倉庫的不同環(huán)節(jié)都可能發(fā)生由產(chǎn)毒真菌引起的腐敗，這取決于一系列相互作用的生物和非生物因素［4－5］。水分活性(aw)是食品質(zhì)量控制中的一個(gè)重要指標(biāo)。通過利用水分活性可以控制食品微生物的污染，因此，在考慮一種食品的質(zhì)量與微生物腐敗之間的關(guān)系時(shí)，水分活性是極其有用的［6］。研究表明大多數(shù)細(xì)菌在水分活度0.91以下停止生長(zhǎng)，大多數(shù)霉菌在水分活度0.8以下停止生長(zhǎng)［7］。所以谷物水分活度對(duì)于儲(chǔ)藏期谷物的微生物安全至關(guān)重要。前人關(guān)于稻谷在儲(chǔ)藏過程中的霉變研究主要集中在不同水分含量稻谷的霉變規(guī)律和霉變防控技術(shù)［8－11］，而關(guān)于稻谷水分活度與霉變關(guān)系的研究以及稻谷和糙米在儲(chǔ)藏過程中的霉變風(fēng)險(xiǎn)差異研究較少。本研究旨在通過在實(shí)驗(yàn)室對(duì)稻谷和糙米接種高產(chǎn)毒黃曲霉菌孢子來模擬黃曲霉菌污染過程，比較不同儲(chǔ)藏溫度條件下:1)不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中呼吸速率和CO2總產(chǎn)量的差異;2)不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失(DML)的差異;3)不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中AFB1累積水平的差異。為稻谷儲(chǔ)藏過程中儲(chǔ)存形式和水分活度的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

稻谷:2017年產(chǎn)早秈稻，來自湖南長(zhǎng)沙霞凝國(guó)家糧食儲(chǔ)備庫，初始水分14.2%;黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株NRRL3357為標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)黃曲霉毒素菌株;AflaStarTMR免疫親和柱:美國(guó)Romer公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

安捷倫6890N氣相色譜儀、安捷倫1260Infmity高效液相色譜儀(配有熒光檢測(cè)器和柱溫箱):美國(guó)Agilent公司;JLG－Ⅱ型礱谷機(jī):中儲(chǔ)糧成都糧食儲(chǔ)藏科學(xué)研究所;水分活度儀:美國(guó) AquaLAB公司;DHG－9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 谷物樣品與等溫吸濕曲線的繪制

首先在25℃條件下利用美國(guó)AquaLAB公司的水分活度儀測(cè)定同一批稻谷和糙米的初始水分活度。將已知不同體積的去離子水加入到裝有5 g谷物樣品的25 mL樣品瓶中，樣品瓶密封后再在4℃條件下平衡48 h，期間不斷振蕩搖勻。然后將樣品置于25℃平衡后測(cè)定水分活度，吸濕樣品通過在125℃烘箱中烘干再次稱量樣品干重計(jì)算得到其對(duì)應(yīng)的含水量。最后利用水分活度和含水量數(shù)據(jù)繪制成同一批稻谷和糙米的等溫吸濕曲線，具體方法參照文友先等的方法［12］。

1.3.2 真菌分離和高產(chǎn)毒黃曲霉菌的鑒定和篩選

分離程序:取霉變稻谷粒利用1%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒1 min，清水沖洗30 s，在濾紙上吸干水分后置于麥芽汁瓊脂(MEA)培養(yǎng)基和氯硝胺18%甘油(DG18)瓊脂培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)5粒稻谷?；虿诿琢！Ｓ脽o菌鑷子將稻谷粒和糙米粒等距擺放在MEA和DG18培養(yǎng)基上并在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。將黃曲霉菌單菌落再接種到MEA和DG18培養(yǎng)基上，用以確認(rèn)和隨后篩選高產(chǎn)毒黃曲霉菌。

黃曲霉毒素的定性測(cè)定:利用椰子瓊脂培養(yǎng)基篩選黃曲霉毒素是參考Davis等［13］的方法。培養(yǎng)基制備:將250 mL椰子脂和250 mL去離子水在75℃熱攪拌器中混勻后加入10.0 g瓊脂粉和0.08 g氯霉素，培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后倒入9 cm培養(yǎng)皿中冷卻備用。用無菌接種環(huán)將每種黃曲霉菌株的孢子懸浮液接種到培養(yǎng)平板上。接種過的培養(yǎng)皿在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，在激發(fā)光波長(zhǎng)為365 nm的紫外光照射下觀察是否存在黃曲霉毒素的特有的藍(lán)色熒光，其中B族產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，G組產(chǎn)生黃綠色熒光［14］。陽性對(duì)照為黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株NRRL3357。

AFB1的定量分析參照GB 5009.22—2016方法進(jìn)行。定量分析結(jié)果用于篩選高產(chǎn)毒黃曲霉菌株。

1.3.3 稻谷和糙米感染黃曲霉菌孢子

為了加快谷物霉變速度，本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下通過接種篩選得到的高產(chǎn)毒黃曲霉菌孢子模擬谷物霉變過程。在培養(yǎng)10 d的高產(chǎn)毒菌株培養(yǎng)平板中加入含0.01%吐溫80的無菌水至覆蓋整個(gè)培養(yǎng)平板，用無菌玻璃棒攪勻培養(yǎng)基表面制備得到黃曲霉菌孢子懸浮液(每個(gè)樣品制備100μL)。利用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后，孢子懸浮液用無菌水調(diào)節(jié)孢子溶度為104/mL，也即102個(gè)孢子/g樣品。預(yù)先調(diào)節(jié)到設(shè)定水分活度(0.85、0.90、0.95)的稻谷和糙米接種黃曲霉菌孢子后在25℃和30℃培養(yǎng)箱中儲(chǔ)存10 d，每隔24 h取樣一次。

1.3.4 氣相色譜法測(cè)定呼吸作用

黃曲霉菌感染后的稻谷和糙米瞬時(shí)呼吸作用測(cè)定:將10.0 g感染黃曲霉菌的不同水分活度(0.85、0.90、0.95)稻谷和糙米預(yù)先在 4 mL Chromacol自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中平衡。然后將這些樣品放在用甘油水溶液維持大氣相對(duì)濕度要求的相對(duì)平衡濕度的3 L氣室中待用。氣相色譜儀使用的是帶熱導(dǎo)檢測(cè)器的安捷倫6890N氣相色譜儀，載氣為氦氣。二氧化碳溶度百分比用于計(jì)算呼吸速率R(mg·kg－1·h－1)、CO2累積量和干物質(zhì)損失(DML)。色譜圖通過公式計(jì)算CO2體積:

式中:10.2代表用于日常校準(zhǔn)儀器標(biāo)準(zhǔn)樣品的CO2溶度，隨后計(jì)算呼吸速率R為:

式中:V代表取樣過程中增加空氣的頂部空間體積(共45 mL);d代表CO2的密度(1.977 mg/mL);m代表樣品干重(本實(shí)驗(yàn)為0.01 kg);t代表檢測(cè)持續(xù)時(shí)間(1 h)。各個(gè)條件下干物質(zhì)損失百分比計(jì)算:

式中:T(h)代表實(shí)驗(yàn)持續(xù)周期(本實(shí)驗(yàn)為240 h)。

1.3.5 稻谷和糙米AFB1的提取和定量分析

將10.0 g黃曲霉菌感染后的稻谷和糙米樣品在60℃烘干48 h后用實(shí)驗(yàn)室粉碎機(jī)粉碎后，其中5 g次級(jí)樣品利用AflaStarTMR免疫親和柱提取AFB1用于高效液相色譜熒光法的定量分析，AflaStarTMR免疫親和柱的具體使用方法參見廠家試劑盒說明書。提取純化的AFB1利用三氟乙酸進(jìn)行衍生化，然后用1 mL注射器將樣品通過0.22 mm濾膜過濾的樣品注入液相色譜樣品瓶中用高效液相色譜熒光法進(jìn)行定量分析，定量分析方法參照 1.3.2。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩個(gè)處理數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩個(gè)以上處理數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(Two－way ANOVA)進(jìn)行比較，p－values＜0.05視為不同處理具有顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中呼吸速率和CO2累積量的比較

通過瞬時(shí)呼吸速率計(jì)算稻谷和糙米在儲(chǔ)藏過程中發(fā)生霉變所產(chǎn)生的二氧化碳總量。圖1結(jié)果表明，發(fā)生霉變后隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)稻谷和糙米的呼吸速率和總CO2累積量不斷增加，其中0.95水分活度儲(chǔ)存稻谷和糙米的呼吸速率和總CO2累積量顯著高于0.85和0.90水分活度稻谷和糙米(P＜0.05)。而稻谷和糙米的比較發(fā)現(xiàn)，糙米的呼吸速率和總CO2累積量均較稻谷高，其中高水分活度糙米更顯著。說明在儲(chǔ)藏過程中隨著霉變的發(fā)生糙米的呼吸速率較稻谷快，其總呼吸量較稻谷多。且谷物水分活度越大，在儲(chǔ)存過程中其呼吸速率和總CO2累積量越大。

圖1 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中呼吸速率和CO2累積量變化

2.2 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失的比較

不同水分活度稻谷和糙米不同儲(chǔ)存溫度條件下霉變過程中干物質(zhì)損失的比較結(jié)果表明，接種黃曲霉菌后，儲(chǔ)存10 d的稻谷和糙米干物質(zhì)損失率隨著谷物水分活度和溫度的增加而增加。其中稻谷的干物質(zhì)損失較糙米少，高水分活度(0.95)稻谷的干物質(zhì)損失率約為4%而糙米約為15%～20%。有趣的是高水分活度(0.95)稻谷在25℃儲(chǔ)存條件下干物質(zhì)損失率較30℃儲(chǔ)存條件下干物質(zhì)損失率高，這與糙米結(jié)果有所差異(圖2a，圖2b)。

2.3 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中AFB1累積的比較

不同水分活度稻谷和糙米不同儲(chǔ)存溫度條件下霉變過程中AFB1累積的比較結(jié)果表明，接種AFB1后，儲(chǔ)存10 d的稻谷和糙米AFB1的含量隨著谷物水分活度和儲(chǔ)存溫度的增加而增加。所有接種過黃曲霉菌的樣本儲(chǔ)存10 d后檢測(cè)到的AFB1累積水平都高于我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的稻谷和糙米中AFB1限量水平(10μg/kg)，但糙米中黃曲霉毒素B1的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于稻谷中的含量，說明糙米在儲(chǔ)存過程中更易發(fā)生霉變。在同一谷物水分活度條件下，儲(chǔ)存溫度的升高會(huì)導(dǎo)致AFB1累積量的增加。所以高溫高水分活度儲(chǔ)存條件有利于黃曲霉菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致AFB1污染加重，而糙米較之稻谷更易受黃曲霉菌的侵染，加重AFB1的污染(圖2c，圖2d)。

圖2 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失和AFB1累積的比較

干物質(zhì)損失是霉菌生長(zhǎng)消耗造成的，而進(jìn)一步分析稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失和AFB1累積量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者具有高度相關(guān)性，其中稻谷和糙米霉變過程中二者的相關(guān)系數(shù)分別為0.992和0.985 9(圖3)，干物質(zhì)損失由谷物的呼吸速率決定，所以通過谷物的呼吸速率預(yù)測(cè)谷物霉變過程中真菌毒素累積的風(fēng)險(xiǎn)具有一定的可行性。

圖3 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失和AFB1累積量的相關(guān)性分析

3 討論

本研究?jī)?chǔ)存10 d的稻谷和糙米干物質(zhì)損失率隨著谷物水分活度和溫度的增加而增加的結(jié)果與研究人員在燕麥和玉米中發(fā)現(xiàn)干物質(zhì)損失受水分活度顯著影響的結(jié)果一致［15－16］。而稻谷干物質(zhì)損失較糙米低，可能是因?yàn)榈竟容^糙米的呼吸速率低，另稻谷具有保護(hù)作用的稻殼，而糙米中的淀粉更容易被真菌所利用導(dǎo)致的［17］。同時(shí)，糙米營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的高利用率導(dǎo)致了更快的真菌繁殖力，更高的谷物呼吸速率和更多的谷物干物質(zhì)損失，尤其是在高水分活度(0.95)處理?xiàng)l件下干物質(zhì)損失更多。有趣的是0.95水分活度稻谷的最大干物質(zhì)損失率出現(xiàn)在25℃條件下而不是30℃條件，這可能是由于25℃儲(chǔ)存條件下是稻谷中自然攜帶的真菌菌株的最佳生長(zhǎng)環(huán)境溫度導(dǎo)致的。

接種黃曲霉菌孢子的高水分活度稻谷和糙米在儲(chǔ)存10 d后AFB1累積量最高。這一結(jié)果與AFB1在稻谷中最佳產(chǎn)毒環(huán)境范圍為溫度在25到30℃之間，水分活度接近0.99的研究結(jié)果相似［18］。小麥中的研究表明水分活度對(duì)AFB1累積量的影響較溫度高［19］。但也有些研究表明，溫度和水分活度的相互作用條件下由于傳毒媒介和菌株品系的不同，AFB1的累積量會(huì)不同。而糙米中的毒素累積量大于稻谷再次證明了稻殼對(duì)米粒的物理保護(hù)作用。對(duì)于高溫高濕儲(chǔ)存條件地區(qū)，糙米的品質(zhì)劣變和毒素污染風(fēng)險(xiǎn)更大，這些地區(qū)應(yīng)采取稻谷儲(chǔ)存方式并注意儲(chǔ)存環(huán)境的濕度變化。

本研究結(jié)果還表明谷物的實(shí)時(shí)呼吸速率用于預(yù)測(cè)谷物霉變過程中真菌毒素累積的風(fēng)險(xiǎn)具有一定的可行性。大米呼吸作用的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等產(chǎn)后管理措施應(yīng)該考慮被用作真菌活動(dòng)的早期指標(biāo)，以防加工大米受真菌的侵染和毒素累積污染。劉焱等［20］通過對(duì)儲(chǔ)糧霉變產(chǎn)氣與毒素含量變化的相關(guān)性進(jìn)行分析，得出快速生長(zhǎng)及產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)氣會(huì)出現(xiàn)明顯的加速現(xiàn)象，且產(chǎn)氣速率變化時(shí)間比產(chǎn)毒時(shí)間提前一周左右。所以產(chǎn)氣的加速特點(diǎn)可以應(yīng)用于對(duì)實(shí)倉中霉變危害的預(yù)測(cè)，而對(duì)毒素的提前預(yù)測(cè)作用，則可以對(duì)儲(chǔ)糧中產(chǎn)生毒素的情況進(jìn)行提前預(yù)警，降低儲(chǔ)糧受毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)。耿旭等［21］也研究了不同生理狀態(tài)霉菌活動(dòng)導(dǎo)致糧堆中CO2濃度變化的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)可以通過糧堆CO2濃度變化監(jiān)測(cè)結(jié)果了解儲(chǔ)糧中霉菌活動(dòng)的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而甄別儲(chǔ)糧受霉菌危害的風(fēng)險(xiǎn)程度。所以通過綜合谷物加工、真菌侵染、真菌毒素的產(chǎn)生、谷物呼吸速率變化和谷物干物質(zhì)損失臨界條件的研究用于預(yù)測(cè)谷物儲(chǔ)存品質(zhì)劣變的生物模型可以更好的進(jìn)行谷物產(chǎn)后儲(chǔ)存管理。