1株雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

宋新宇 ， 張 青 ， 郭莉莉 ， 竇小龍 ， 趙 鵬 ， 郎 楓 ， 范根成

(動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省畜禽動(dòng)物疫苗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島市畜禽疫苗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島易邦生物工程有限公司 ， 山東青島266114)

雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)是冠狀病毒科的雞傳染性支氣管炎病毒屬RNA病毒，該病毒基因組具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄合成機(jī)制，再加上自然進(jìn)化、多株免疫和高密度飼養(yǎng)等客觀因素造成野毒和疫苗毒大量長(zhǎng)期共存，使得IBV極容易發(fā)生點(diǎn)突變、基因缺失、插入以及基因重組等，進(jìn)而導(dǎo)致IBV不斷產(chǎn)生變異，新的血清型和基因型不斷出現(xiàn)[1、2]。目前，IBV的血清型已達(dá)26種之多，并仍有不斷上升的勢(shì)頭。而在實(shí)際生產(chǎn)中，免疫失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，使得傳染性支氣管炎成為禽病防治中難于控制的“頑癥”。因此,研究不同地區(qū)IBV的發(fā)生、進(jìn)行血清學(xué)鑒定和分子病原學(xué)研究，一直是該病研究的焦點(diǎn)，對(duì)于從根本上控制傳染性支氣管炎具有重要意義。生物學(xué)特性研究不但對(duì)IBV分離株的鑒定提供了一種可靠的診斷方法，而且也是對(duì)分離株進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。

為更好地服務(wù)市場(chǎng)，本公司一直跟蹤研究不同地區(qū)IBV的發(fā)生情況。本文針對(duì)2015年從江蘇某疑似傳染性支氣管炎雞群分離到的一株傳染性支氣管炎病毒，進(jìn)行了初步鑒定及生物學(xué)特性研究。

1 材料

1.1 病料 2015年從江蘇某疑似傳染性支氣管炎雞群無(wú)菌采集發(fā)病雞氣管、腎臟和腺胃。

1.2 引物 參照GenBank收錄的IBV S1基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)，由上海Invitrogen公司合成。如下所示：

上游引物S1-F∶5′-TATTGATTAGAGATGTTG GG-3′;

下游引物S1-R∶5′-CATAACTAACATAAGGGCAA-3′。

1.3 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒，購(gòu)自TIANGEN公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶及RNA酶抑制劑，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 SPF種蛋 購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.5 SPF雞 SPF種蛋，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，購(gòu)回后在公司動(dòng)物房孵化出雛，負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

1.6 試驗(yàn)場(chǎng)地 青島易邦生物工程有限公司技術(shù)中心及動(dòng)物房。

2 方法

2.1 病毒的分離 取發(fā)病雞氣管、腎臟和腺胃，用無(wú)菌生理鹽水勻漿制成20%懸液，每毫升加入2 000 IU青霉素、鏈霉素，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清除菌后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，置37 ℃孵育觀察，孵化144 h，收毒。然后按此方法連傳5代。

2.2 分離株P(guān)CR鑒定及序列分析 取分離株第6代毒進(jìn)行S1基因的RT-PCR擴(kuò)增，序列測(cè)定與基因CenBank中的IBV序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

2.3 分離株毒價(jià)測(cè)定 將分離株第6代病毒液10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8 四個(gè)稀釋度，每稀釋度尿囊腔接種10日齡SPF雞胚各5枚，每胚0.1 mL，設(shè)同日齡未接種SPF胚5枚作對(duì)照，置36 ℃～37 ℃繼續(xù)孵育，每日照胚2次，剔除24 h以前的死胚，至144 h，取出所有活胚。接種后雞胚在24～144 h全部或部分死亡，存活雞胚胎兒出現(xiàn)失水、蜷縮、發(fā)育小(接毒胎兒比對(duì)照最輕胎兒重量低2 g以上)等特異性病痕判為感染，計(jì)算EID50。

2.4 無(wú)菌檢驗(yàn) 取分離毒第6代，按2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄[3]進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.5 外源病毒檢驗(yàn) 取分離毒第6代，按2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄[3]進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.6 分離株的血凝特性檢測(cè) 取分離株第6代病毒液先按2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄[4]進(jìn)行血凝效價(jià)測(cè)定；再將第6代病毒液經(jīng)2個(gè)單位的卵磷脂酶C 37 ℃水浴2 h，檢測(cè)對(duì)雞紅細(xì)胞的凝集價(jià)，并用分離株的高免血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。

2.7 分離株的部分理化特性檢測(cè)

2.7.1 耐熱性試驗(yàn) 分離株病毒液56 ℃水浴分別處理30 min，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育觀察。

2.7.2 pH值穩(wěn)定性試驗(yàn) 分離株第6代毒在pH值3.0和pH值12.0環(huán)境下室溫作用3 h，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育觀察。

2.7.3 脂溶劑敏感試驗(yàn) 分離株病毒液經(jīng)氯仿、乙醚分別處理30 min，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育觀察。

2.7.4 胰蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn) 分離株第6代毒經(jīng)1%胰酶37 ℃處理1 h，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚0.2 mL/枚，置37 ℃孵育觀察。

2.8 電鏡觀察 取分離株第6代病毒液，12 000 r/min(4 ℃)離心30 min，取其沉淀用2%磷鎢酸染色2 min，電鏡觀察病毒形態(tài)。

2.9 分離株的致病力試驗(yàn)

2.9.1 對(duì)不同日齡SPF雛雞的致病力試驗(yàn) (1)人工感染試驗(yàn)：用分離株強(qiáng)毒滴鼻104.0EID50/只，分別接種7、21、60日齡SPF雞，每個(gè)日齡10只，同時(shí)各日齡設(shè)10只不攻毒作空白對(duì)照。分別置于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)，觀察試驗(yàn)雞的發(fā)病情況；(2)病理學(xué)觀察：對(duì)人工感染7、21、60日齡試驗(yàn)發(fā)病和死亡的雞進(jìn)行系統(tǒng)的剖檢，觀察各臟器的病理變化；(3)病毒的分離：取人工感染試驗(yàn)發(fā)病或死亡雞的氣管、腎臟用無(wú)菌生理鹽水勻漿成10%懸液，過(guò)濾除菌后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，分離病毒。

2.9.2 最小致病量試驗(yàn) 將分離株病毒液稀釋成104.0EID50、103.0EID50、102.0EID50、5×101.0EID50，分別滴鼻接種21日齡SPF雞，每組10只，隔離飼養(yǎng)，觀察試驗(yàn)雞的生長(zhǎng)和發(fā)病情況。觀察結(jié)束后進(jìn)行剖檢，觀察各臟器的病理變化。分組及接種情況見表1。

表1 雞傳染性支氣管炎病毒分離株不同接種劑量攻毒分組情況

2.10 免疫原性試驗(yàn) 將滅活的分離株病毒液與白油佐劑按1∶ 2比例制備油苗，以0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL劑量免疫21日齡SPF雞各10只，肌肉注射。同時(shí)設(shè)同條件未免疫對(duì)照雞10只。免疫后21 d用分離株滴鼻攻毒，104.0EID50/只，攻毒后觀察14 d，記錄發(fā)病情況。

3 結(jié)果

3.1 病毒分離結(jié)果 將采集到的病料處理后接種10日齡SPF雞胚，盲傳6代，到第6代部分雞胚出現(xiàn)早期死亡，死亡雞胚全身出血明顯，未死雞胚發(fā)育受阻，呈明顯的侏儒胚、蜷縮胚變化；各代尿囊液HA效價(jià)呈陰性。

3.2 分離株S1基因RT-PCR擴(kuò)增及分子進(jìn)化樹分析結(jié)果 分離株S1基因RT- PCR擴(kuò)增可見到清晰的1.7 kb左右大小的條帶，與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果相符。從進(jìn)化樹看，分離株屬于當(dāng)前IBV主要流行的QX型。序列比對(duì)結(jié)果見圖1。

3.3 分離株毒價(jià)測(cè)定 取分離株第6代毒種測(cè)定病毒含量，結(jié)果顯示，分離株第6代病毒含量為106.1EID50/0.1 mL。

3.4 無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果 按2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果無(wú)菌生長(zhǎng)。

圖1 分離株與GenBank中收錄的IB毒株S1基因分子進(jìn)化樹

3.5 外源病毒檢驗(yàn)結(jié)果

3.5.1 雞胚檢查法

3.5.1.1 尿囊腔途徑 雞胚均10/10存活，取雞胚液作血凝試驗(yàn)，均為陰性。

3.5.1.2 絨毛尿囊膜途徑 雞胚均10/10存活，胎兒均發(fā)育正常，絨毛尿囊膜也無(wú)病變；取雞胚液作血凝試驗(yàn)，均為陰性。

3.5.2 細(xì)胞檢查法 (1)細(xì)胞觀察：取2個(gè)方瓶(100 mL容量)的雞胚成纖維細(xì)胞(培養(yǎng)24 h左右)，接種病毒血清混合物0.2 mL，培養(yǎng)7 d，細(xì)胞均無(wú)病變；(2)紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)：結(jié)果紅細(xì)胞均被洗去，無(wú)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。

3.6 分離株的血凝特性檢驗(yàn)結(jié)果 按2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄方法測(cè)定病毒液血凝效價(jià)為陰性，用卵磷脂酶C處理后HA為7log2，并能特異性地被分離株的高免血清所抑制。

3.7 理化特性測(cè)定結(jié)果

3.7.1 耐熱性試驗(yàn)結(jié)果 56 ℃水浴30 min，分離株毒力幾乎不受影響。結(jié)果見表2。

3.7.2 pH值穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 在室溫下進(jìn)行，分離株對(duì)pH值3和pH值12均有不同程度的耐受力，分離株對(duì)pH值3的耐受力比pH值12好。結(jié)果見表2。

3.7.3 脂溶劑敏感性試驗(yàn)結(jié)果 分離株對(duì)乙醚和氯仿均敏感。結(jié)果見表2。

3.7.4 胰蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 分離株經(jīng)胰蛋白酶處理后毒力略有下降。結(jié)果見表2。

表2 理化特性測(cè)定結(jié)果

-：表示測(cè)不到

3.8 電鏡觀察結(jié)果 將分離株第6代病毒液電鏡

觀察均可見到完整的病毒粒子，直徑80～120 nm，有囊膜、囊膜表面有纖突，頂部膨大，長(zhǎng)約20 nm，突起末端呈球狀，整個(gè)突起呈梨狀，整個(gè)病毒呈皇冠狀，未見非目的病毒。見圖2。

圖2 分離株病毒液負(fù)染后經(jīng)電鏡觀察可見到典型的冠狀病毒

3.9 分離株毒力試驗(yàn)結(jié)果

3.9.1 對(duì)不同日齡SPF雛雞的致病力試驗(yàn)結(jié)果

3.9.1.1 人工感染試驗(yàn)結(jié)果 用分離株第6代病毒液接種7、21、60日齡SPF雞，接種后3～5日開始發(fā)病，先出現(xiàn)呼吸異常，拉稀，精神差，漸進(jìn)性消瘦、死亡。見表3。

表3 分離株攻毒后發(fā)病死亡統(tǒng)計(jì)

3.9.1.2 剖檢病變觀察結(jié)果 7、21、60日齡SPF雞攻毒后病死雞的剖檢病理變化基本相同。腎臟腫大，有尿酸鹽沉積(呈花斑腎)，輸尿管、泄殖腔有尿酸鹽沉積；氣管有不同程度的出血，有黏液；肺臟不同程度出血；個(gè)別腺胃腫脹，腔上囊腫脹。對(duì)照雞無(wú)明顯變化。

3.9.1.3 病毒的分離結(jié)果 人工感染試驗(yàn)中采集發(fā)病或死亡雞的氣管、腎臟組織制成懸液，在10日齡SPF雞胚中盲傳兩代，接種病毒后144 h可見明顯的侏儒胚、蜷曲胚。

3.9.2 分離株最小致病量試驗(yàn)結(jié)果 用不同劑量分離株第6代毒分別接種21日齡SPF雞。結(jié)果顯示，不同劑量分離株攻擊21日齡SPF雞，104.0EID50攻擊10/10發(fā)病，6/10死亡；103.0EID50攻擊10/10發(fā)病，4/10死亡；102.0EID50攻擊8/10發(fā)病，3/10死亡；5×101.0EID50攻擊6/10發(fā)病，1/10死亡。發(fā)病雞臨床主要表現(xiàn)為精神沉郁、采食下降、羽毛蓬松、兩翅下垂、脫水，爪子發(fā)干，拉白色或水樣稀便，有不同程度的呼吸道癥狀、漸進(jìn)性消瘦、死亡。不同劑量發(fā)病死亡雞病變基本一致，表現(xiàn)為腎臟腫大，有尿酸鹽沉積(呈花斑腎)，泄殖腔有尿酸鹽；氣管環(huán)有不同程度的出血，有黏液；個(gè)別雞腺胃腫脹，腔上囊腫脹。結(jié)果見表4。

3.10 免疫原性試驗(yàn)結(jié)果 分離株滅活苗按不同劑量免疫后，免疫組0.25 mL/只～1.0 mL/只保護(hù)8/10～10/10，對(duì)照組發(fā)病8/10。結(jié)果見表5。

4 討論

4.1 大量的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，近年來(lái)國(guó)內(nèi)流行的IBV毒株處于持續(xù)不斷的進(jìn)化當(dāng)中，根據(jù)韓宗璽等[4]對(duì)1995-2009年共計(jì)15年間國(guó)內(nèi)可檢索到S1基因全長(zhǎng)序列的所有IBV分離株進(jìn)行的遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)至少同時(shí)流行10個(gè)以上基因型的IBV毒株，但QX型(也稱LX4型)為最主要的優(yōu)勢(shì)基因型(54.1%)。根據(jù)最近的研究報(bào)道，在2009年以后的國(guó)內(nèi)分離株中，QX型毒株所占的比重至少在75%以上[5-8]。QX型原型株QX株最早于1996年分離自青島某發(fā)生腺胃炎的雞群[9]，但直到2004年該型病毒才被證實(shí)在國(guó)內(nèi)廣泛流行，臨床表現(xiàn)主要為腎病變型[10]；而同期包括俄羅斯、荷蘭、比利時(shí)、德國(guó)、法國(guó)等在內(nèi)的多個(gè)歐洲國(guó)家也在同一時(shí)期發(fā)現(xiàn)存在該型毒株的流行，但臨床表現(xiàn)主要是與引起“假母雞”有關(guān)[11]。另外張小榮、劉勝旺等人的研究結(jié)果，說(shuō)明2018年流行的IBV也主要是以QX型為主[12-13]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)上市的IBV QX型疫苗。

表4 分離株的最小致病量試驗(yàn)結(jié)果

表5 免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

4.2 為跟蹤市場(chǎng)IB流行情況，研制新的疫苗，我們不斷從各地分離IBV。本文針對(duì)2015年我們從江蘇某疑似IB的雞場(chǎng)分離到一株病毒進(jìn)行鑒定。結(jié)果電鏡觀察可見直徑為80～120 nm，有囊膜和纖突的冠狀病毒粒子。分離株對(duì)熱、酸、堿和胰蛋白酶均有一定的耐受力，對(duì)脂溶劑敏感。與賀秀媛等人的研究結(jié)果相一致[14]。這符合傳染性支氣管炎病毒具有囊膜這一特征。

4.3 從進(jìn)化樹分析，該分離株屬于當(dāng)前主要流行的QX型，與張小榮、劉勝旺等[12-13]人的研究結(jié)果相一致。我公司跟蹤市場(chǎng)調(diào)研結(jié)果結(jié)合張小榮、劉勝旺等人的研究結(jié)果分析，IBV當(dāng)前除主要的QX型外還有HN-08型、LSC/99I型、LDT3/03型、TW-I型、Mass型、CH VI型、TW-II型和793/B型等。說(shuō)明國(guó)內(nèi)IBV是在不斷變異的。

4.4 該分離株致病力結(jié)果顯示，人工攻毒后，臨床能復(fù)制出典型的病例，發(fā)病雞主要表現(xiàn)呼吸異常、拉稀、精神差、漸進(jìn)性消瘦、死亡等。剖檢發(fā)病雞腎臟腫大，有尿酸鹽沉積(呈花斑腎)，輸尿管、泄殖腔有尿酸鹽沉積；氣管有不同程度的出血，有黏液；肺臟不同程度出血；個(gè)別腺胃腫脹，腔上囊腫脹。102.0EID50/只的分離株攻擊能達(dá)到80%的發(fā)病率，因此分離株的最小致病量定為102.0EID50/只。考慮到實(shí)際應(yīng)用中各種因素對(duì)病毒的影響，為保證攻毒結(jié)果成立，攻毒劑量采用最小致病量的2倍劑量，即為104.0EID50/只。分離株對(duì)不同日齡SPF雞的致病力不同，日齡越小，發(fā)病率和死亡率越高。說(shuō)明該分離株是株致病性比較典型的IBV。

4.5 該分離株免疫原性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株滅活疫苗按0.25 mL/只～1.0 mL/只免疫21日齡SPF雞保護(hù)達(dá)8/10～10/10，從試驗(yàn)結(jié)果看，0.25 mL/只即可達(dá)到良好的免疫效果。說(shuō)明該毒株具有良好的免疫原性。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，該分離株即有良好的免疫原性，又能復(fù)制出典型病例。說(shuō)明該毒株是個(gè)不錯(cuò)的傳染性支氣管炎病疫苗候選株。這為后期產(chǎn)品開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。