銀連解毒口服液提取工藝研究

趙增成 ， 李桂明 ， 宋敏訓 ， 李 穎 ， 楊世發(fā) ， 黃中利 ， 馮敏燕 ， 傅 劍 ， 林樹乾

(山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所 ， 山東濟南250023)

銀連解毒口服液是我們研發(fā)的新獸藥，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、牛蒡子、竹葉、甘草等組成。功效為辛涼解表，清熱解毒，可用于家禽溫熱疾病的防治。因處方中，薄荷、荊芥含有揮發(fā)油成分，且具有重要的生物活性，因此先采用共水蒸餾法對薄荷、荊芥進行了揮發(fā)油提取，提取后的藥渣與剩余藥味再進行煎煮水提。為了篩選出最佳的提取工藝參數(shù)，對提取工藝中的最重要影響因素加水量、浸泡時間、提取時間、提取次數(shù)進行了篩選研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀、AB265-S型雙量程十萬分之一電子天平、KQ5200DB型超聲儀、揮發(fā)油測定器。

1.2 藥品與試劑 綠原酸對照品、牛蒡苷對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院。各中藥飲片，購自濟南宏濟堂藥店。乙腈為色譜純試劑，甲醇、磷酸均為分析純試劑。

1.3 揮發(fā)油提取工藝篩選 為了篩選出薄荷、荊芥中揮發(fā)油的最佳提取條件，提高揮發(fā)油提取率，采用單因素試驗對影響揮發(fā)油提取率的主要因素提取時間、加水量、浸泡時間進行考察。

1.3.1 加水量的考察 按處方比例，稱取薄荷60 g、荊芥40 g，共100 g，分別加入6倍、8倍、10倍量的水，用揮發(fā)油測定器進行蒸餾，提取5 h，記錄出油量。

1.3.2 浸泡時間的考察 稱取薄荷60 g、荊芥40 g，共100 g，加入8倍量的水，分別浸泡0.5 h、1 h、2 h，用揮發(fā)油測定器進行蒸餾，提取5 h，記錄出油量。

1.3.3 提取時間的考察 稱取薄荷60 g、荊芥40 g共100 g，用揮發(fā)油測定器進行蒸餾，分別在開始回流后的不同時間，記錄出油量。

1.4 中藥浸泡時間篩選 中藥的浸泡時間與吸水率對提取有一定的影響，但中藥的浸泡一般按完全浸透為原則。取處方量的中藥飲片1 000 g，加入6倍量的水浸泡，每間隔0.5 h，觀察1次浸潤程度，并將水過濾盡，稱量濕藥重量，計算吸水率，記錄吸水率達到飽和的時間。

吸水率=(藥材濕重-藥材干重)/藥材干重×100%

1.5 煎煮工藝篩選 在確定了藥材浸泡時間后，采用正交試驗對本品煎煮工藝進行了篩選研究，選定加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)3個因素，以干膏量、綠原酸含量和牛蒡苷含量為評價指標，對最佳提取工藝進行優(yōu)選。

1.5.1 試驗設計 選取中藥加水量(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(shù)(C) 3個因素，進行3因素3水平篩選試驗，因素水平試驗設計見表1。選用正交表L9(34)進行正交試驗設計[1-2]，共進行9組試驗，正交試驗方案見表2。

1.5.2 試驗方法 按處方比例稱取相同的中藥飲片共9份，每份1 000 g，其中薄荷、荊芥取蒸餾后的藥渣，按表2試驗條件分別進行煎煮，濾過，煎煮液最后濃縮至1 g/mL。

表1 煎煮工藝因素水平表

表2 煎煮工藝正交試驗

取蒸發(fā)皿9個，105 ℃干燥至恒重，精密稱定其重量。分別精密吸取所制備的9份中藥濃縮液各10 mL至上述蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，置105 ℃干燥3 h，轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻0.5 h，精密稱定，所得重量減去蒸發(fā)皿重量，即得干膏重量。

分別對制備的9份中藥濃縮液，按制定的銀連解毒口服液質(zhì)量標準草案，以高效液相色譜法(HPLC)對綠原酸、牛蒡苷含量進行測定。

1.5.3 綠原酸含量測定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)為流動相；檢測波長為327 nm。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于1 000。

對照品溶液的制備：取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含40 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

供試品溶液的制備：精密量取本品2 mL，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲20 min，搖勻，即得。

測定法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

1.5.4 牛蒡苷含量測定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.4%磷酸溶液(25∶75)為流動相，檢測波長為277 nm，理論板數(shù)按牛蒡苷峰計算應不低于1 000。

對照品溶液的制備：取牛蒡苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.6 mg 的溶液，即得(10℃以下保存)。

供試品溶液的制備：精密量取本品5 mL，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20 min，混勻。

測定法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測定，即得。

1.5.5 統(tǒng)計方法 以干膏量、綠原酸含量、牛蒡苷含量作為評價指標，設定三者的加權系數(shù)分別為0.4、0.3、0.3，采用綜合加權評分法，計算出各次試驗的綜合評分。具體評分方法：以干膏重量最大的1次試驗判為100分，按照每次試驗干膏量與最大干膏量的比例，計算各自干膏量指標中的得分。同法，分別計算每次試驗的綠原酸和牛蒡苷含量得分。最后按照3項指標的加權系數(shù)，計算出各次試驗的綜合評分。

根據(jù)綜合評分結果，采用極差法進行最佳因素排序，并得出最優(yōu)組合。采用方差分析，得出各因素對評價指標的顯著影響程度。

2 結果與分析

2.1 揮發(fā)油提取結果

2.1.1 不同加水量揮發(fā)油提取結果 加水量對揮發(fā)油提取量具有一定的影響，加8倍量水時，揮發(fā)油提取量最多。詳見表3。

表3 不同加水量薄荷、荊芥揮發(fā)油累計提取量 (mL)

2.1.2 不同浸泡時間揮發(fā)油提取結果 中藥浸泡時間對揮發(fā)油提取量影響不明顯，本著節(jié)約時間和提高效率的原則，浸泡時間確定為0.5 h。見表4。

2.1.3 不同蒸餾時間揮發(fā)油提取結果 試驗表明，加熱蒸餾1 h內(nèi)出油最快，且已基本提盡，綜合考慮能源的節(jié)約，提取時間選擇為蒸餾1 h。見表5。

表4 不同浸泡時間薄荷、荊芥中揮發(fā)油累計提取量 (mL)

表5 不同時間薄荷、荊芥中揮發(fā)油提取量

2.2 藥材浸泡時間及吸水率考察結果 不同浸泡時間藥材的吸水率情況，見表6。

表6 不同浸泡時間藥材吸水率

由表6可知，當浸泡2 h時，吸水已達到飽和狀態(tài)，此時藥材已完全浸透，吸水率為 220% ，因此確定藥材最佳浸泡時間為2 h。

2.3 煎煮工藝正交試驗結果 正交試驗的結果見表7，方差分析結果見表8。

表7 正交試驗結果

表8 正交試驗結果方差分析

極差直觀分析結果表明，影響因素大小為C>A>B，即煎煮次數(shù)>加水量>煎煮時間。優(yōu)選條件為A3B3C3。

方差分析結果表明，A(加水量)、B(煎煮時間)、C因素(煎煮次數(shù))對評價指標均具有顯著影響(P<0.05)。

綜合分析以上結論，最佳工藝參數(shù)選擇為：加水量為10倍藥量，煎煮時間為1.5 h，共煎煮3次。

3 討論

3.1 本試驗確定出了處方藥物薄荷、荊芥的揮發(fā)油最佳提取工藝，即將中藥飲片加8倍量水，浸泡0.5 h，蒸餾提取1 h，可取得最佳的提取效益。

3.2 通過浸泡試驗和正交試驗，綜合考慮干膏量、綠原酸含量、牛蒡苷含量3項評價指標，將最佳煎煮工藝確定為：加水量為10倍藥量，浸泡2 h，每次煎煮1.5 h，共煎煮3次。

3.3 薄荷、荊芥中含有大量的揮發(fā)油成分，現(xiàn)代研究表明，揮發(fā)油具有抗炎、抗病毒、抑菌、解熱鎮(zhèn)痛等作用[3-4]，是不可缺少的有效成分，發(fā)揮著重要的治療作用。但揮發(fā)油有非常強的揮發(fā)性，且水溶解性較差，不能大量溶解于水[5-6]。如果將薄荷、荊芥與其他的藥物放在一起直接煎煮，揮發(fā)油成分就可能全部損失掉，嚴重影響藥物的療效。因此，將薄荷、荊芥采用了先單獨提取揮發(fā)油的生產(chǎn)工藝。

3.4 本制劑中金銀花清熱解毒、辛涼透表為主藥，牛蒡子疏散風熱、解毒利咽為臣藥。金銀花的主要活性成分為綠原酸，牛蒡子的主要活性成分為牛蒡苷，它們均是重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒等作用[7-8]，因此將綠原酸、牛蒡苷含量作為工藝篩選的評價指標。