金芪枳術(shù)湯對(duì)糖尿病胃輕癱GK大鼠胃動(dòng)力的影響

萬生芳 李雅琪 王曉麗

摘要：目的 觀察金芪枳術(shù)湯對(duì)糖尿病胃輕癱（DGP）GK大鼠胃動(dòng)力的影響，探討其作用機(jī)制。方法 80只雄性GK大鼠隨機(jī)選取12只作為正常組，其余68只給予高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)8周制備DGP模型，成模大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥組和金芪枳術(shù)湯低、中、高劑量組，干預(yù)12周，測(cè)定胃內(nèi)色素殘留率，ELISA檢測(cè)血漿多巴胺（DA）、乙酰膽堿（ACh）、5-羥色胺（5-HT）含量，HE染色觀察胃竇組織病理變化，透射電鏡觀察胃竇組織黏膜層超微結(jié)構(gòu)，Western blot檢測(cè)胃竇組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組胃內(nèi)色素殘留率升高，DA、ACh、5-HT含量降低，RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)降低（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和金芪枳術(shù)湯高劑量組胃內(nèi)色素殘留率降低，DA、ACh、5-HT含量明顯升高，RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01），胃竇組織病理變化和黏膜層超微結(jié)構(gòu)明顯改善；與陽性藥組比較，金芪枳術(shù)湯高劑量組胃內(nèi)色素殘留率、DA含量及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與金芪枳術(shù)湯低劑量組比較，金芪枳術(shù)湯高劑量組胃內(nèi)色素殘留率明顯降低，DA、ACh、5-HT含量明顯升高，RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 金芪枳術(shù)湯能提高DGP大鼠胃動(dòng)力，促進(jìn)胃排空，改善和修復(fù)胃竇組織黏膜層損傷，這可能與其調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號(hào)通路蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病胃輕癱；金芪枳術(shù)湯；多巴胺；乙酰膽堿；5-羥色胺；RhoA/ROCK信號(hào)通路

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0056-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Jinqi Zhizhu Decoction （JQZZD） on gastric motility of GK rats with diabetic gastroparesis （DGP）； To discuss its mechanism of action. Methods 12 out of 80 male GK rats were randomly selected as normal group， and others were induced to be DGP model by irregular feeding with high sugar and high fat diet for 8 weeks. The model rats were randomly divided into model group， positive medicine group， JQZZD low-， medium-， and high-dose groups. All rats were given continuous intragastric administration for 12 weeks. The residual rate of pigment in stomach was detected and calculated. The concentration of DA， ACh and 5-HT in plasma were detected by ELISA. The morphological changes of gastric antrum were observed by HE staining. The ultrastructure of mucous layer of gastric antrum was observed by transmission electron microscope. The protein expressions of RhoA， ROCK1 and ROCK2 were detected by Western blot. Results Compared with normal group， the residual rate of pigment in model group increased， while DA， ACh and 5-HT， relative amount of protein expressions of RhoA， ROCK1 and ROCK2 decreased （P<0.01）. Compared with model group， the residual rate of pigment in positive medicine group and JQZZD high-dose group decreased， while DA， ACh and 5-HT， relative amount of protein expressions of RhoA， ROCK1 and ROCK2 increased （P<0.05， P<0.01）， and morphological changes and ultrastructure of mucous layer obviously improved. There was no significant differences in the residual rate of pigment， DA content and protein expressions of RhoA， ROCK1 and ROCK2 between positive medicine group and JQZZD high-dose group （P>0.05）. Compared with JQZZD low-dose group， the residual rate of pigment in JQZZD high-dose group decreased， while DA， ACh and 5-HT， relative amount of protein expressions of RhoA， ROCK1 and ROCK2 increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion JQZZD may improve gastric motility， promote gastric emptying， and improve and repair damage of mucous membrane in the gastric antrum. All of these may be related to regulating protein expressions of RhoA/ROCK signal pathway.

Keywords： diabetic gastroparesis； Jinqi Zhizhu Decoction； dopamine； ACh； 5-HT； RhoA/ROCK signaling pathway

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）消化道慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高。DGP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與胃神經(jīng)病變、胃平滑肌細(xì)胞受損等因素有關(guān)，其主要病理特征和核心環(huán)節(jié)是平滑肌細(xì)胞受損，RhoA/ROCK信號(hào)通路是平滑肌收縮調(diào)節(jié)的重要機(jī)制，RhoA是Ras同源物基因組成員之一，RhoA活化后引起一系列下游效應(yīng)器激活，促進(jìn)平滑肌收縮。多巴胺（DA）、乙酰膽堿（ACh）和5-羥色胺（5-HT）等神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)于胃腸道平滑肌的收縮均有明顯的興奮作用。本實(shí)驗(yàn)以DGP大鼠為研究對(duì)象，觀察金芪枳術(shù)湯對(duì)DGP大鼠胃內(nèi)色素殘留率，DA、ACh和5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)活性，胃竇黏膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及胃竇組織RhoA/ROCK信號(hào)通路相關(guān)因子RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)的影響，探討其促進(jìn)胃動(dòng)力的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)GK大鼠80只，雄性，9周齡，體質(zhì)量（180±20）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物

金芪枳術(shù)湯（雞內(nèi)金、紅芪、枳殼、白術(shù)、黃連、法半夏等），飲片均購于蘭州惠仁堂大藥房，按傳統(tǒng)中藥煎煮方法浸泡、煎煮、過濾，恒溫水浴濃縮為5.54 g原藥材/mL藥液；枸櫞酸莫沙必利片，成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)170216。

1.3 主要試劑與儀器

DA、ACh、5-HT ELISA試劑盒，江蘇菲亞生物科技有限公司；抗RhoA一抗，美國Abcam公司；抗ROCK1一抗，美國Genetex公司，抗ROCK2一抗，美國Genetex公司。酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS，352型），透射電鏡（日本Olympus公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模和分組

GK大鼠隨機(jī)選取12只作為正常組，其余68只參照文獻(xiàn)[1-3]方法給予高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)8周，隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L，腹部脹大、體質(zhì)量減輕，隨機(jī)抽查胃排空率降低，提示模型復(fù)制成功。60只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥組和金芪枳術(shù)湯低、中、高劑量組，每組12只。陽性藥組予莫沙必利藥液0.7 mg/（200 g·d）灌胃，金芪枳術(shù)湯低、中、高劑量組分別予金芪枳術(shù)湯1.38、2.77、5.54 g/（200 g·d）灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。給藥體積1 mL/（200 g·d），連續(xù)12周。

2.2 取材

干預(yù)第12周末，大鼠禁食不禁水24 h，1 mg/mL美藍(lán)溶液0.4 mL灌胃，30 min后處死大鼠，取全胃，生理鹽水沖洗胃殘留物并收集沖洗液，離心，取上清液，測(cè)定胃內(nèi)色素殘留率。股動(dòng)脈取血，保留部分血漿，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存。取胃竇一部分組織，多聚甲醛固定，用于光鏡下病理觀察。取胃竇部5 mm×5 mm×2 mm大小的組織塊，戊二醛固定液固定，透射電鏡觀察胃竇組織黏膜層超微結(jié)構(gòu)。一部分胃竇組織液氮冷凍保存，用于檢測(cè)胃竇平滑肌RhoA/ROCK信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)因子蛋白表達(dá)。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 胃內(nèi)色素殘留率

大鼠處死后開腹取全胃，沿胃大彎剪開，胃內(nèi)殘留物用6 mL生理鹽水沖洗并收集沖洗液。3500 r/min離心15 min，取上清液，于波長(zhǎng)620 nm處檢測(cè)吸光度（OD）。另取一試管，同一濃度色素0.4 mL，相同條件下離心，測(cè)OD，作為標(biāo)準(zhǔn)管。胃內(nèi)色素殘留率（%）=測(cè)定管OD值÷標(biāo)準(zhǔn)管OD值×100%。

2.3.2 神經(jīng)遞質(zhì)含量檢測(cè)

酶標(biāo)儀檢測(cè)大鼠血漿DA、ACh、5-HT的含量，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.3.3 病理觀察

胃竇組織4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

2.3.4 胃竇組織黏膜層超微結(jié)構(gòu)觀察

取胃竇5 mm×5 mm×2 mm，戊二醛固定液固定，蔗糖磷酸緩沖液洗滌2次，四氧化鋨固定2 h，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，透射電鏡下觀察，拍照。

2.3.5 Western blot檢測(cè)胃竇組織RhoA、ROCK1、ROCK2的蛋白表達(dá)

取胃竇組織50 mg，提取蛋白質(zhì)，按照試劑盒操作說明進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入抗RhoA、ROCK1、ROCK2一抗和內(nèi)參β-actin（濃度1∶1000）培育過夜。凝膠成像顯影拍照，圖像分析軟件進(jìn)行分析，各組整合灰度值與內(nèi)參β-actin比較，計(jì)算RhoA、ROCK1、ROCK2的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用方差分析，組間多重比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

4 結(jié)果

4.1 大鼠一般狀況

正常組大鼠飲食正常，營養(yǎng)狀況良好，毛色有光澤，反應(yīng)敏捷，體質(zhì)量漸增；模型組大鼠多飲、多食、多尿明顯，精神萎靡，毛色無光澤。模型組大鼠死亡2只，金芪枳術(shù)湯低、中、高劑量組大鼠各死亡3、2、1只。干預(yù)12周后，各給藥組大鼠一般狀況較模型組明顯改善。

4.2 金芪枳術(shù)湯對(duì)模型大鼠胃內(nèi)色素殘留率的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃內(nèi)色素殘留率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和金芪枳術(shù)湯低、中、高劑量組大鼠胃內(nèi)色素殘留率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），金芪枳術(shù)湯高劑量組與陽性藥組比較無明顯差異（P>0.05）；金芪枳術(shù)湯低劑量組大鼠胃內(nèi)色素殘留率高于金芪枳術(shù)湯高劑量組（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.3 金芪枳術(shù)湯對(duì)模型大鼠血漿多巴胺、乙酰膽堿、5-羥色胺的影響

與正常組比較，模型組大鼠血漿DA、ACh、5-HT含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和金芪枳術(shù)湯低、中、高劑量組大鼠DA、ACh、5-HT含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；金芪枳術(shù)湯高劑量組大鼠ACh、5-HT含量顯著高于陽性藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；金芪枳術(shù)湯高劑量組大鼠ACh、5-HT含量較金芪枳術(shù)湯低、中劑量組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.4 金芪枳術(shù)湯對(duì)模型大鼠胃竇組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠胃竇組織結(jié)構(gòu)正常，未見充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠黏膜下毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，有炎性細(xì)胞浸潤，腺體排列紊亂；陽性藥組大鼠充血、浸潤、空泡等病變均有所改善；金芪枳術(shù)湯各劑量組大鼠上述病變均明顯改善，金芪枳術(shù)湯高劑量組效果最明顯。結(jié)果見圖1。

4.5 金芪枳術(shù)湯對(duì)模型大鼠胃竇組織黏膜層超微結(jié)構(gòu)的影響

正常組大鼠胃竇黏膜細(xì)胞間聯(lián)系緊密，胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量豐富；模型組大鼠細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞核變形，線粒體腫脹、變性甚至溶解；陽性藥組大鼠無細(xì)胞核變形、染色質(zhì)增多現(xiàn)象，線粒體腫脹、溶解的數(shù)量較模型組減少；金芪枳術(shù)湯低劑量組大鼠出現(xiàn)細(xì)胞核變形，異形染色質(zhì)增多，細(xì)胞質(zhì)邊集，細(xì)胞凋亡；金芪枳術(shù)湯中、高劑量組大鼠線粒體腫脹、變性數(shù)量少于模型組，高劑量組細(xì)胞核無變形、染色質(zhì)增多等異?，F(xiàn)象。結(jié)果見圖2。

4.6 金芪枳術(shù)湯對(duì)模型大鼠胃竇組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和金芪枳術(shù)湯高劑量組大鼠RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；金芪枳術(shù)湯高劑量組大鼠RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)顯著高于金芪枳術(shù)湯低劑量組（P<0.01），陽性藥組與金芪枳術(shù)湯高劑量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3、圖3。

5 討論

金芪枳術(shù)湯為甘肅省名中醫(yī)吳紅彥教授臨床治療糖尿病胃動(dòng)力不足經(jīng)驗(yàn)方，由枳術(shù)丸合小陷胸湯化裁而來，方中含雞內(nèi)金、紅芪、枳殼、白術(shù)、黃連、法半夏、丹參等藥，全方共奏健脾益氣、消食和胃、除痞止嘔、行氣化瘀、清熱生津的功效。枳術(shù)丸、小陷胸湯加減治療DM及其并發(fā)癥療效確切[4-5]。雞內(nèi)金消食導(dǎo)滯兼化瘀滯，紅芪為甘肅道地藥材，益氣健脾升陽，雞內(nèi)金和紅芪主要成分均有較好降血糖作用。RhoA/ROCK信號(hào)通路在體內(nèi)普遍存在，介導(dǎo)DM多種并發(fā)癥的發(fā)生[6]，DGP的發(fā)生與RhoA/ROCK信號(hào)通路被抑制有關(guān)[7-8]，ROCK活化后能增強(qiáng)平滑肌的收縮力[9]。ACh是胃腸道最主要的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠興奮胃腸道平滑肌，使其收縮幅度、張力、蠕動(dòng)增加。DA、5-HT是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，DA參與對(duì)胃腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)作用，5-HT有興奮哺乳動(dòng)物胃腸運(yùn)動(dòng)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DGP模型大鼠胃竇組織RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)較正常組明顯減少，提示RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表達(dá)下調(diào)、活性被抑制與DGP胃動(dòng)力不足有一定相關(guān)性。干預(yù)12周后，陽性藥組和金芪枳術(shù)湯高劑量組RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)增加，表明金芪枳術(shù)湯能提高RhoA/ROCK信號(hào)通路的活性。

本研究中，模型組胃內(nèi)色素殘留率升高，神經(jīng)遞質(zhì)分泌減少，胃黏膜細(xì)胞破壞明顯，干預(yù)12周后，陽性藥組和金芪枳術(shù)湯各劑量組胃內(nèi)色素殘留率顯著降低，神經(jīng)遞質(zhì)分泌明顯增加，黏膜損傷程度得到明顯改善，表明金芪枳術(shù)湯能夠促進(jìn)胃排空，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)分泌，在一定程度上修復(fù)損壞的胃黏膜。金芪枳術(shù)湯保護(hù)胃黏膜和促進(jìn)胃動(dòng)力的作用機(jī)制可能與促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)分泌、上調(diào)RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王飛，郭沛然，韓菲，等.益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠平滑肌細(xì)胞凋亡的影響[J].世界華人消化雜志，2014，22（13）：1848-1853.

[2] 彭艷，賀鳳娥，萬全荃，等.電針對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠胃竇Ghrelin和GHSR蛋白及基因表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2016，22（8）：1088-1091.

[3] 段衛(wèi)娜，張振凌，孔瑩瑩，等.地黃生熟異用對(duì)增液湯降低糖尿病大鼠血糖的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（1）：266-268.

[4] 李曉玲，張聲生，楊成，等.枳術(shù)丸對(duì)功能性消化不良大鼠胃平滑肌收縮反應(yīng)及胃促生長(zhǎng)素受體蛋白表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2016，36（2）：210-215.

[5] 趙曉敏，杜學(xué)榮.加味小陷胸湯治療功能性消化不良32例療效觀察[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（7）：1741.

[6] 張默函，蔡英蘭，樸麗花，等.糖尿病胃癱大鼠胃竇平滑肌自噬相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)變化及其意義[J].中國糖尿病雜志，2014，22（7）：653-655.

[7] 孫曉萌，朱瀅，王慶娥，等.RhoA/ROCK信號(hào)通路在糖尿病結(jié)腸肌層中的表達(dá)[J].胃腸病學(xué)，2014，19（11）：673-677.

[8] BHETWAL B P， AN C， BAKER S A， et al. Impaired contractile responses and altered expression and phosphorylation of Ca2+ sensitization proteins in gastric antrum smooth muscles from ob/ob mice[J]. Muscle Res Cell Motil，2013，34（2）：137-149.

[9] WANG Y P， MEREDITH B， NADEENE R， et al. ROCK isoform regulation of myosin phosphatase and contractility in vascular smooth muscle cells[J]. Circ Res，2009，104：531-540.

（收稿日期：2017-12-14）

（修回日期：2018-01-25；編輯：華強(qiáng)）