皮膚生物樣本中角鯊烯的氣相色譜法檢測及氣相色譜-質(zhì)譜確證

陳云霞*， 閆 妍， 蘇 寧， 王秀娟， 蔡天培， 鄭 君，王 聰， 劉 娟， 于紅梅

(中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176)

人體皮膚用于保護體內(nèi)各組織和器官免受外界有害因素的傷害，并能防止體內(nèi)的水分以及營養(yǎng)物質(zhì)等成分的流失，是人體的第一道生理屏障。皮膚中的脂質(zhì)成分在保障皮膚屏障功能上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，當皮膚脂質(zhì)成分或含量發(fā)生變化時，皮膚的屏障功能就會受到一定影響，進而影響皮膚的生理狀態(tài)[1 - 2]。在皮膚病學領(lǐng)域，脂質(zhì)成分對人體皮膚疾病的影響已經(jīng)被證實，因此，脂類組學的研究逐漸成為了研究焦點[3 - 5]。研究表明，皮膚脂質(zhì)成分的分泌過程，以及主要成分角鯊烯(Squalene)、神經(jīng)酰胺(Ceramides,CERs)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、游離脂肪酸(Free Fatty Acids,FFAs)等的含量、結(jié)構(gòu)或比例變化，都會干擾皮膚的屏障功能[6]。皮膚屏障的最外層是水質(zhì)膜，其中的脂質(zhì)成分主要來自皮脂腺和汗腺的分泌，其中角鯊烯在皮膚水質(zhì)膜中，又名三十碳六烯、鯊烯、魚肝油萜等，是一種高度不飽和三萜類物質(zhì)，是角質(zhì)層中潤澤脂質(zhì)，在皮膚脂質(zhì)中占12%，是皮膚保濕和抗衰老的重要指標，因此，角鯊烯的含量變化在一定程度上能指示皮膚的生理狀態(tài)。

目前，對于角鯊烯含量的測定主要應(yīng)用于植物油、魚肝油等食品和保健品領(lǐng)域，文獻報道角鯊烯的檢測方法主要有氣相色譜法[7 - 8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9 - 10]、液相色譜法[11 - 12]等。而對皮膚生物樣本中角鯊烯含量檢測鮮有報道。本研究建立了測定皮膚生物樣本中角鯊烯的氣相色譜分析及質(zhì)譜確證方法，對于皮膚病學、脂類組學以及化妝品研究領(lǐng)域具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6890型氣相色譜儀(美國，Agilent公司)；-80 ℃冰箱(Thermo Scitifict公司)；皮膚貼片(美國，CuDerm公司)。

角鯊烯標準品(中國食品藥品檢定研究院)；正己烷、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取角鯊烯標準物質(zhì)10 mg(精確至0.1 mg)，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為1 000 μg/mL的標準儲備液。將標準儲備溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/mL的系列混合標準溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1皮膚生物樣本制備志愿者先經(jīng)過洗頭后，平衡30 min，采用tape-striping技術(shù)用貼片取得頭皮樣本，放入2 mL的離心管中，含樣本的一側(cè)向內(nèi)，放入-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2皮膚樣本預處理向有頭皮樣本的離心管中加入1 mL正己烷，旋渦提取1 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液供氣相色譜測定。

1.4 儀器條件

1.4.1氣相色譜條件色譜柱：Agilent HP-5柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣：高純氮氣；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：290 ℃，分流比：10∶1，壓力：9.85 psi，隔墊吹掃流量：3 mL/min；火焰離子化檢測器溫度：300 ℃，空氣流量300 mL/min，氫氣燃氣流量：30 mL/min，尾吹氣流量：25 mL/min；升溫程序：250 ℃保持1 min；15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min；運行時間15 min。

1.4.2氣相色譜-質(zhì)譜確證條件氣相色譜條件：Agilent HP-5MS柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL/min；進樣口溫度290 ℃，分流比10∶1，進樣量1 μL；升溫程序為250 ℃保持1 min；15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min；運行時間15 min。質(zhì)譜條件:接口溫度 280 ℃；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式EI源；電離能量70 eV；全掃描監(jiān)測模式檢測，質(zhì)量掃描范圍m/z20～500；溶劑延遲3 min。

角鯊烯標準溶液的氣相色譜圖見圖1。角鯊烯標準溶液的氣-質(zhì)確證譜圖見圖2。

圖1 角鯊烯標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of squalene standard solution

圖2 角鯊烯標準溶液的GC-MS譜圖Fig.2 GC-MS spectrum of squalene standard solution

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理與實驗條件的優(yōu)化

2.1.1生物樣本的制備目前提取皮膚表面脂質(zhì)的方法主要是通過醫(yī)院渠道獲得角質(zhì)層碎屑，再進行有機溶劑提取分離，或是直接在皮膚表面用合適的有機溶劑萃取皮膚表面的脂質(zhì)成分，或者直接刮取皮膚分泌物。由于上述方法取樣困難、對皮膚刺激性大，本文選擇使用脂帶法，通過涂有粘性材料的貼片貼取含有角鯊烯的皮膚樣本，放入2 mL離心管中，-80 ℃保存。

2.1.2提取溶劑的選擇本實驗考察了角鯊烯在乙腈、甲醇、正己烷、四氯化碳等有機提取溶劑的提取效果，渦旋提取時間均為1 min。角鯊烯易溶于非極性有機溶劑，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，皮膚樣本中角鯊烯能被正己烷和四氯化碳充分提取。綜合考慮毒性和普適性，本研究選擇正己烷為最佳提取溶劑。

2.1.3提取時間的選擇在空白樣品貼片中定量添加角鯊烯標準溶液，并放置至溶劑完全揮干。在2.1.1實驗條件下，分別渦旋提取0.1、0.5、1、2、5 min，結(jié)果表明，隨著提取時間的增加，提取效率先增加，但當渦旋提取時間超過1 min后，提取率基本保持不變，因此確定渦旋提取時間為1 min。

2.1.4色譜柱的選擇角鯊烯沸點高，是難揮發(fā)性物質(zhì)，且易溶于非極性有機溶劑，因此本研究選擇普適性強，且分離該物質(zhì)良好的HP-5弱極性色譜柱。HP-5色譜柱耐高溫，柱流失小，通過較高初始柱溫，可大大縮短樣本中角鯊烯的分析時間。因此，綜合考慮色譜峰分離度和分析時間，最終選擇采用Agilent HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。

2.1.5程序升溫條件的選擇角鯊烯的沸點285 ℃，升溫程序為250 ℃保持1 min，以15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min，運行時間15 min。實驗選擇較高的初始溫度，可以使低沸點物質(zhì)迅速氣化出峰，縮短目標物的分析周期。選擇15 ℃/min的速率升至280 ℃，使得角鯊烯能夠完全出峰，并能很好避免與干擾物質(zhì)同時出峰。

2.2 方法學考察

2.2.1線性關(guān)系和定量限將角鯊烯標準儲備溶液逐級稀釋得到濃度為2、5、10、20、50、100 μg/mL的混合標準工作溶液，按1.4節(jié)的測定條件進樣分析，以角鯊烯的峰面積(Y)對相應(yīng)的濃度(X)繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：Y=2.05X+0.70，相關(guān)系數(shù)為0.9998，線性范圍2～100 μg/mL方法的檢出限(S/N=3)為1 μg，定量限(S/N=10)為2 μg。

2.2.2回收率和精密度以經(jīng)過測定不含有角鯊烯的貼片空白樣品為基質(zhì)，分別進行空白樣品添加回收率和精密度的測定。在2、4、20 μg三個加標水平下，每個水平平行測定6次，角鯊烯的平均回收率范圍為96.0%～100.2%，相對標準偏差(RSD)為1.43%～3.79%。本方法在一日內(nèi)不同時間和不同日期(5 d內(nèi))測得的日內(nèi)和日間RSD分別為1%和2%。

2.3 質(zhì)譜確證

圖3 實際樣本中角鯊烯檢測結(jié)果Fig.3 Detection result of squalene in head skin sample

陽性樣品需用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用進行確認實驗，如果皮膚樣本中的角鯊烯色譜峰的保留時間與標準工作溶液一致(變化范圍在±2.5%之內(nèi))，樣品中角鯊烯的兩個子離子的相對豐度與濃度相當標準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過2.2.2的規(guī)定，則可判斷樣品中在相應(yīng)保留時間內(nèi)檢出的物質(zhì)為角鯊烯。

2.4 樣品的測定

實驗共選取20例頭皮健康的志愿者(按八分法的評分標準，該組志愿者頭屑評分≥2.5分)，其中男10例，女10例；年齡24～57歲。經(jīng)相同洗發(fā)水洗發(fā)后，再平衡30 min，用tape-striping技術(shù)進行樣本采集，得到相應(yīng)的頭皮生物樣本。應(yīng)用本方法，對其頭皮樣本中的角鯊烯含量進行測定，其結(jié)果見圖3。

3 結(jié)論

本文建立了皮膚生物樣本中角鯊烯的氣相色譜分析方法及氣相色譜-質(zhì)譜確證方法，該方法具有操作簡便、回收率高、精密度好等特點，滿足皮膚生物樣本中角鯊烯含量測定的需求，為生物樣本中化合物的檢驗鑒定提供了較為實用有效的分析方法，為皮膚健康狀況評價奠定基礎(chǔ)。