溫補(bǔ)脾腎法對(duì)脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠結(jié)腸組織趨化因子信號(hào)通路的影響

殷銀霞，劉永華，吳玉泓，謝守嬪，程小麗，田一虹，王園園，李海龍

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518116； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 蘭州 370000； 3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000； 4. 甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000； 5. 蘭州市第一人民醫(yī)院， 蘭州 730000)

潰瘍性結(jié)腸炎是以腹痛、腹瀉、里急后重及黏液膿血樣便為主的常見(jiàn)炎癥性腸病。前期研究表明[1]，理中湯合四神丸中藥復(fù)方顆?？梢种芃yD88、IRAK1的表達(dá),影響MyD88信號(hào)通路的傳導(dǎo), 達(dá)到治療脾腎陽(yáng)虛型UC的目的。在UC等炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)中，腸道屏障受損，腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IECs)表現(xiàn)出趨化因子的差異性表達(dá)[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，在結(jié)腸炎結(jié)腸組織活檢中的同一趨化因子組占總黏膜反應(yīng)的主導(dǎo)地位，UC組的表達(dá)更為明顯。因此，趨化因子在潰瘍性結(jié)腸炎中起著重要作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證其在脾腎陽(yáng)虛型UC發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)基于第二代測(cè)序技術(shù)篩選脾腎陽(yáng)虛型UC的差異表達(dá)基因，觀察趨化因子信號(hào)通路(chemokine signaling pathway)中相關(guān)趨化因子的基因的表達(dá)變化情況，從中尋找溫補(bǔ)脾腎法中藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的特異性靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠96只，雌雄各半，體重(170±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(甘)2015-0002】，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)環(huán)境內(nèi)【SYXK(甘)2015-0005】。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則(倫理審批號(hào)：2015-079)。

1.1.2 藥物、試劑

大黃水煎液(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，批號(hào)20170306)，氫化可的松注射液(國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號(hào)1406418-A11)，三硝基苯磺酸(Sigma公司，批號(hào)SLBP08899 V)，柳氮磺胺吡啶腸溶片(上海信誼制藥公司，批號(hào)09141010)，RNAiso PLUS 熒光定量試劑盒(美國(guó)Promega公司，批號(hào)0000231060)，理中湯合四神丸復(fù)方顆粒(甘肅眾友健康醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20140721)，4%多聚甲醛(北京Solarbio公司，批號(hào)20160315)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司，批號(hào)0000232248)，CXCL1基因上下游引物(批號(hào)：CHPN132-05/ CHPN132-06)，CXCL2基因上下游引物(批號(hào)：CHPN132-07/ CHPN132-08)，CXCL6基因上下游引物(批號(hào)：CHPN132-03/ CHPN132-04)，CCL7基因上下游引物(批號(hào)：CHPN132-11/ CHPN132-12)，CCL12基因上下游引物(批號(hào)：CHPN132-13/ CHPN132-14)，CXCR2基因上下游引物(批號(hào)：CHPN132-01/ CHPN132-02)，所有引物均由大連寶生物工程有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

電子天平(德國(guó)賽多利斯，CPA124S)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(凱達(dá)集團(tuán)成員高科技公司，TGL16 M)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(美國(guó)Bio-rad公司，CFX96)，高速冷凍離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備工程公司，CT14RD)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將96只Wistar大鼠雌雄各半分開(kāi)按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、SASP組雌雄各8只(造模成功后分組給藥治療模型組不給藥)。本研究采用本課題組前期的研究成果所建立的脾腎陽(yáng)虛型UC病證結(jié)合模型制備方法[5]復(fù)制脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠模型。造模成功后，第2天開(kāi)始灌胃給藥，1次/日，連續(xù)21 d。根據(jù)體型系數(shù)，大鼠給藥劑量換算為成人劑量之10、5、2.5倍，即高、中、低劑量給藥劑量分別為13.5，6.75，3.375 g/kg的生藥劑量，SASP組為0.2 g/kg，空白組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，體積為10 mL/kg。觀察大鼠每天的精神、飲食、毛發(fā)色澤、大便性狀等情況，記錄各組大鼠體重，1次/周。模型組大鼠在造模14 d末、其他各組大鼠在用藥21 d末，禁食24 h，用水合氯醛麻醉后，打開(kāi)腹腔，剪取8 cm結(jié)腸組織，沿縱軸剪開(kāi)，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，置于濾紙上吸干水分，根據(jù)Strober等[6]提出的大鼠結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，觀察各組大鼠黏膜組織的充血、水腫、潰爛程度進(jìn)行評(píng)分。留取病變的結(jié)腸組織，一部分用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)HE染色后制作病理切片，另一部分用凍存管保存于-80℃超低溫冰箱，將用于后期檢測(cè)。

1.2.2 病理切片的制備、觀察

取出固定于4%多聚甲醛溶液中的病變結(jié)腸組織，石蠟包埋后制作病理切片，再進(jìn)行HE染色。參照Geboes 等[7]提出的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)切片進(jìn)行觀察評(píng)分。

1.2.3 高通量測(cè)序

分別選取空白組大鼠結(jié)腸組織與模型組大鼠病變部位結(jié)腸組織進(jìn)行高通量測(cè)序，高通量測(cè)序以及基因差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因GO富集分析和Pathway富集分析由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。根據(jù)q-value0.05,Fold-change1.5的條件篩選差異基因。

1.2.4 Real Time-qPCR法檢測(cè)差異表達(dá)基因

常規(guī)提取RNA，合成cDNA。各基因的上下游引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度如表 1。擴(kuò)增反應(yīng)：總體系為10 μL，預(yù)變性，PCR反應(yīng)循環(huán)40次，溶解，每個(gè)樣本重復(fù)4孔，PCR反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否有非特異性擴(kuò)展；分析擴(kuò)增曲線，得出CT值，按照相對(duì)定量法調(diào)用機(jī)器附帶軟件包計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表 1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for each gene

2 結(jié)果

2.1 一般生存情況

模型組大鼠普遍精神不佳、畏寒扎堆，進(jìn)食量下降，毛發(fā)疏散、色澤枯槁，出現(xiàn)黏液、膿血大便，體重下降?？瞻捉M大鼠表現(xiàn)如常。各治療組大鼠經(jīng)治療后普遍好轉(zhuǎn)，精神轉(zhuǎn)佳，反應(yīng)靈活，活動(dòng)增加，飲食增加，除個(gè)別大便偏軟，其余基本成形，毛發(fā)出現(xiàn)光澤。(大鼠死亡情況：模型組3只，高劑量組2只，中劑量組1只，低劑量組1只，SASP組3只)。

2.2 大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)變化

2.2.1 肉眼觀察空白組與模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)變化

模型組大鼠黏膜充血水腫、腸壁增厚，可見(jiàn)潰瘍及糜爛。與正常的空白組大鼠結(jié)腸組織相比較，模型組大鼠結(jié)腸組織評(píng)分為(4.67±0.58)，差異有顯著性(P<0.05)。

2.2.2 光學(xué)顯微鏡下觀察空白組與模型組大鼠結(jié)腸組織病理切片結(jié)果

模型組大鼠結(jié)腸組織可見(jiàn)黏膜層及黏膜下層有大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層見(jiàn)膠原纖維與成纖維細(xì)胞形成的肉芽組織，部分上皮組織脫落、壞死?？瞻捉M大鼠結(jié)腸組織黏膜層組織完整，可見(jiàn)黏膜表面的單直管狀腺體，基本未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

注：A) 模型組大鼠結(jié)腸組織病理切片結(jié)果；B) 空白組大鼠結(jié)腸組織病理切片結(jié)果。圖1 病理切片結(jié)果Note. A) Rat model group. B) Rat blank group.Figure 1 pathological changes in the rat colon tissues

按照鏡下大鼠結(jié)腸黏膜組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，與空白組相比較，模型組大鼠評(píng)分為(13.67±0.58)，差異具有顯著性(P< 0.01)。

2.3 大鼠結(jié)腸組織樣本總RNA質(zhì)量控制

對(duì)送檢的大鼠結(jié)腸組織樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各樣本RNA在18 s、28 s處見(jiàn)明顯峰值(見(jiàn)圖2)，RIN(RNA完整系數(shù))≥6.0且28 s/18 s≥0.7，說(shuō)明RNA樣本無(wú)真核或原核生物污染；無(wú)DNA或蛋白污染；無(wú)過(guò)多的5 s rRNA。質(zhì)檢結(jié)果類別為A1，符合電泳結(jié)果，總量達(dá)2次及以上，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 RNA樣本電泳圖Figure 2 RNA electrophoregram

2.4 空白組大鼠與模型組大鼠相應(yīng)結(jié)腸組織基因的差異性表達(dá)分析

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，與模型組大鼠相比較，根據(jù)q-value0.05，F(xiàn)old-change1.5篩選出空白組大鼠差異表達(dá)的基因216個(gè)，其中下調(diào)166個(gè)和上調(diào)84個(gè)。相對(duì)于模型組大鼠，表達(dá)下調(diào)的基因明顯多于表達(dá)上調(diào)的基因，表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)目是表達(dá)上調(diào)的1.96(166/84)倍。兩組之間的差異表達(dá)基因用火山圖(見(jiàn)圖 3)，可以大致顯示出差異表達(dá)基因上調(diào)、下調(diào)的數(shù)量情況以及所占全部基因的比率。

2.5 差異表達(dá)基因的GO分析結(jié)果

將篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)三個(gè)層次的統(tǒng)計(jì)分析，其中BP 3158個(gè)、CC 1863個(gè)、MF 695個(gè)，見(jiàn)圖 4所示。

2.6 差異表達(dá)基因Pathway分析結(jié)果

Pathway分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)mRNA主要富集于細(xì)胞因子受體相互作用、吞噬小體、ECM-受體相互作用、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、抗原加工提呈、PI3K-Akt信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、腫瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)、炎癥性腸疾病、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞黏附、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、錯(cuò)配修復(fù)、NF-κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Nod樣受體信號(hào)通路等炎癥相關(guān)通路，見(jiàn)表2。

2.7 大鼠結(jié)腸組織趨化因子mRNA的表達(dá)

RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組結(jié)腸組織比較，模型組中CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表達(dá)量明顯提高，差異有顯著性(P< 0.01);與模型組結(jié)腸組織相比較，各治療組中CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表達(dá)量明顯下降，差異有顯著性(P< 0.01)；與測(cè)序結(jié)果一致。(見(jiàn)表3)

注：紅色表示上調(diào)差異基因，藍(lán)色表示下調(diào)差異基因。圖3 空白組與模型組大鼠結(jié)腸組織基因的差異性表達(dá)分析Note. Red indicates upregulated genes, blue indicates downregulated genes.Figure 3 Differentially expressed genes

圖4 差異表達(dá)基因的GO功能分類統(tǒng)計(jì)圖Figure 4 Gene Ontology classifications of the differentially expressed genes

信號(hào)通路Pathways基因數(shù)Diff gene in this pathway富集程度rich_factorPQ-valuerno04060:Cytokine-cytokine receptor interaction193.30 1.00E-057.27E-04rno04145:Phagosome112.57 3.89E-037.07E-02rno04062:Chemokine signaling pathway112.37 7.18E-038.24E-02rno04514:Cell adhesion molecules (CAMs)92.37 1.32E-021.25E-01rno04512:ECM-receptor interaction73.44 2.74E-036.65E-02rno04668:TNF signaling pathway72.44 2.02E-021.63E-01rno03320:PPAR signaling pathway62.99 1.01E-021.00E-01rno04621:NOD-like receptor signaling pathway42.67 3.89E-022.42E-01rno04920:Adipocytokine signaling pathway42.07 9.64E-024.29E-01rno04620:Toll-like receptor signaling pathway51.99 9.06E-024.11E-01rno04612:Antigen processing and presentation41.96 1.16E-014.86E-01rno04151:PI3K-Akt signaling pathway161.90 1.55E-021.30E-01rno04630:Jak-STAT signaling pathway71.79 9.79E-024.27E-01rno05321:Inflammatory bowel disease (IBD)31.78 1.87E-016.28E-01rno05202:Transcriptional misregulation in cancer71.66 1.36E-015.20E-01rno04064:NF-kappa B signaling pathway41.66 2.00E-016.52E-01rno04670:Leukocyte transendothelial migration51.65 1.80E-016.33E-01rno04010:MAPK signaling pathway111.65 8.80E-024.08E-01rno04510:Focal adhesion81.53 1.77E-016.33E-01

表 3 各組大鼠結(jié)腸組織相關(guān)趨化因子mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 3 Relative expression of s, n=4)

注：與模型組相比，△P< 0.01。

Note. Compared with the model group,△P< 0.01.

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是發(fā)生于結(jié)腸黏膜組織的非特異性腸道炎癥，其發(fā)病原因不明確。本研究應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)，通過(guò)比較空白組大鼠正常的結(jié)腸組織與模型組大鼠病變的結(jié)腸組織的基因表達(dá)差異，試圖找到與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)的特異性基因，為中醫(yī)藥治療UC的機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。通過(guò)肉眼及電子顯微鏡下觀察空白組大鼠與模型組大鼠的結(jié)腸黏膜組織，根據(jù)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，可以初步認(rèn)為模型復(fù)制成功。

對(duì)差異基因進(jìn)行GO和Pathway功能富集分析結(jié)果顯示，涉及的差異表達(dá)基因多與組織的損傷密切相關(guān)，其中趨化因子信號(hào)通路與UC炎癥活動(dòng)增強(qiáng)有直接的關(guān)系。趨化因子由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，靶細(xì)胞表達(dá)的同源性趨化因子受體與之結(jié)合后被激活，進(jìn)一步對(duì)循環(huán)白細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，使白細(xì)胞整合素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的親和力增加，促使白細(xì)胞在組織間隙中聚集[8-9]。趨化因子能夠粘附在細(xì)胞表面的糖胺聚糖上，使局部病灶的趨化劑濃度升高[10]。上皮細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體與趨化因子結(jié)合，具有定向遷移白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞以及搬運(yùn)造血干細(xì)胞的典型生物特征[11-12]，成為趨化因子信號(hào)通路的重要組成部分。

在本研究中脾腎陽(yáng)虛型UC的大鼠組結(jié)腸織中僅發(fā)現(xiàn)了一種具有顯著差異表達(dá)的趨化因子受體CXCR2，它是否就是脾腎陽(yáng)虛型UC的特異性靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Buanne等[13]發(fā)現(xiàn)CXCR2基因敲除小鼠UC組織的炎癥浸潤(rùn)明顯減輕，臨床癥狀亦明顯減輕，證明CXCR2在結(jié)腸炎動(dòng)物模型中起著關(guān)鍵的作用。CXCR2抑制劑可以防止多形核白細(xì)胞的再循環(huán)和相關(guān)組織損傷，并進(jìn)行了二期臨床試驗(yàn)[14]，說(shuō)明了CXCR2的高表達(dá)與組織的損傷具有明顯的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在CXCR2基因敲除的小鼠中CXCL1、CXCL2不能被多形核白細(xì)胞遷移[15]。CXCL1、CXCL2、CXCL6等作為CXCR2的特異性配體，在正常的人體與小鼠結(jié)腸組織中正常表達(dá)，在UC患者的黏膜中高表達(dá)[13, 16]。大量研究[17]已證實(shí)了CXCL1趨化中性粒細(xì)胞的性質(zhì)。而中性粒細(xì)胞是抵御感染的關(guān)鍵，CXCL1的表達(dá)能提高宿主防御和預(yù)防疾病的發(fā)生[18]。Shea-Donohue等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL1敲除小鼠的結(jié)腸炎癥表現(xiàn)更嚴(yán)重，病理組織缺少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。CXCL1的過(guò)度表達(dá)可能與UC的嚴(yán)重程度相關(guān)。沈守榮等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL1在UC小鼠模型多種細(xì)胞趨化因子水平中顯著升高，并進(jìn)一步應(yīng)用CXCL1中和抗體治療UC小鼠，有效緩解了UC的進(jìn)展。

Han等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL2介導(dǎo)大鼠腸道炎癥和損傷，通過(guò)阻斷CXCL2可減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。Zahn等[23]研究表明，CXCL2可以作為檢測(cè)UC黏膜炎癥以及監(jiān)測(cè)新藥治療效果的客觀指標(biāo)之一。Wuyts等[24]研究證明，CXCL6通過(guò)與CXCR2結(jié)合發(fā)揮作用，誘導(dǎo)白細(xì)胞趨化、促進(jìn)血管新生成、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等。在UC患者腸組織中發(fā)現(xiàn)，CXCL6選擇性表達(dá)于潰瘍性的黏膜缺損區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞中[25]。炎癥部位的單核細(xì)胞主要由CCL7調(diào)控遷移，炎癥發(fā)生時(shí)，CCL7呈現(xiàn)高表達(dá)[26-27]。在IBD患者身上，CCL7等趨化因子主要參與巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的募集[28]。Uguccioni等[29]研究證明，CCL7在正常對(duì)照組與UC組結(jié)腸組織標(biāo)本中均有表達(dá)，但在UC中表達(dá)明顯上調(diào)。在慢性炎癥中，巨噬細(xì)胞分泌的CCL12表達(dá)上調(diào)，阻止修復(fù)性成纖維細(xì)胞的激活，延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)而不利于組織愈合[30]，這一特點(diǎn)可能是UC病程反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的原因之一。

綜上所述，在脾腎陽(yáng)虛型UC中，以上趨化因子的表達(dá)具有一定特異性，同時(shí)也提示著疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是多種因子相互作用的結(jié)果。本研究得到了脾腎陽(yáng)虛型UC差異表達(dá)的趨化因子基因序列，并應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)差異表達(dá)的趨化因子，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明本次測(cè)序結(jié)果可靠，進(jìn)一步證明了該脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠病證結(jié)合模型具有可行性、合理性及科學(xué)性。CXCL2、CXCL1、CXCR2、CCL12、CXCL6、CCL7等因子在脾腎陽(yáng)虛型UC結(jié)腸組織中表達(dá)明顯上調(diào)，且經(jīng)中西藥治療后，各治療組CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表達(dá)量均顯著下降。所以，本研究發(fā)現(xiàn)的這一系列趨化因子的差異性表達(dá)應(yīng)可作為脾腎陽(yáng)虛型UC的特異性靶點(diǎn)，并作為治療效果及預(yù)后判斷的指標(biāo)。但是在脾腎陽(yáng)虛型UC的發(fā)病過(guò)程中，這一系列趨化因子之間具體的相互作用及影響還不完全清楚，它們的差異表達(dá)是否完全體現(xiàn)出脾腎陽(yáng)虛證的發(fā)病規(guī)律，仍有待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。