雪貂脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、分化與鑒定

石桂英，李珂雅，徐艷峰，韓云林，高舒平

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所, 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室 干細(xì)胞與臨床轉(zhuǎn)化實驗室，北京 100021)

自從Zuk 等[1-2]從人體脂肪抽取物中成功分離出了具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞以來，脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)由于與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有自我更新能力、血管再生潛能、免疫調(diào)節(jié)能力，可以在體外分離、擴增、誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等[3-6],已經(jīng)是干細(xì)胞研究的熱點。雪貂(Mustela pulourius furo)是食肉類動物，屬于鼬科，作為新型的實驗動物，由于他們的大腦功能和生殖生物學(xué)的生理特征以及各種疾病的特征愈加受到人們的重視和廣泛的應(yīng)用，目前已被應(yīng)用于病毒學(xué)、生殖生理、藥理學(xué)等研究。此外，雪貂對一些病毒性疫病具有獨特的敏感性，已被常規(guī)用于人類流感病毒性疾病如H1N1及其疫苗方面的研究，還有諸如麻疹、皰疹性口炎、阿留申病、牛鼻氣管炎及犬瘟熱等模型研究；另有報道證明雪貂適合毒理學(xué)試驗，還可作為小腦發(fā)育不全動物模型研究。近期，有文章報道雪貂可作為研究阻塞性呼吸道疾病的一個高度相關(guān)的模型[7]。王曉群等利用胚胎顯微注射和CRISPR/Cas9技術(shù)，成功對雪貂胚胎進行基因編輯，得到了基因敲除雪貂，實驗結(jié)果顯示基因敲除雪貂與相關(guān)人類大腦疾病患者的表型十分相似，又為人類疾病的致病機理和治療手段的研究提供了新的疾病模型[7]。雪貂有大量的腦白質(zhì)和豐富的多腦回的特殊結(jié)構(gòu)，它們可能是一種用于研究創(chuàng)傷性腦損傷的人類相關(guān)因素的理想的小型哺乳動物模型[8]。因此,分離和建立雪貂脂肪干細(xì)胞系，將會對干細(xì)胞的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，進一步進行雪貂疾病模型的干細(xì)胞治療評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗用雪貂來自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所北方實驗動物研究中【SCXK(京)2014-11】，雄性3只，雌性2只，24～36月齡，體重3～8 kg。動物實驗取材在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所【SYXK(京)2011-0022】。動物實驗方案經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為: BL17002。

1.1.2 實驗試劑

胎牛血清(Gibco)，DMEM(Gibco)，PBS(Gibco)，青、鏈霉素原液(Hyclone公司) Trypsin-EDTA(Gibco BRL公司)，I型膠原酶(Sigma 公司)，成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基均來自于Cyagen公司，Lamnin-111(Stemcell)，F(xiàn)orskolin(Sigma公司)，IBMX(Sigtrm公司)，β-FGF(Stem Cell)，EGF(Stem Cell)，B27(STEM CELL)，油紅O(Amresco公司)；CD29-PE-cy7、CD45-Percp-cy5、CD90-FITC、CD105-APC 及CD11b-APC-Cy7 等單克隆流式抗體均為美國 Pharmingen 公司。

1.1.3 實驗儀器

流式細(xì)胞儀(Aria Ⅱ，Becton Dickinson，美國)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7300，美國)，電泳儀(北京六一儀器廠，中國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，離心機(湘儀離心機有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 脂肪組織的提取與脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)

氯胺酮麻醉處死雪貂后剪毛,碘酊、乙醇消毒，在無菌條件下于腹部做十字切口，皮下游離至腹股溝，采取腹部和腹股溝處皮下脂肪，在無菌條件下把脂肪組織剪碎成0.5 mm2的組織塊，加入2倍體積容量的0.075%Ⅰ型膠原酶在37℃下振蕩消化1 h，進行消化分離。經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過濾，4℃下1500 r/min離心10 min，棄上清。紅細(xì)胞裂解液處理5 min，加入PBS，4℃下1500 r/min離心10 min，棄上清。以4000細(xì)胞/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中。48 h后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞及殘留的紅細(xì)胞。此后每3 d換液，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞達到80%融合時，按1∶3 進行傳代。

1.2.2 生長曲線的測定

采用MTT法，取P3，P4，P5 代對數(shù)生長期細(xì)胞，以 4000細(xì)胞/孔接種96孔板，分為4組，每組三個復(fù)孔，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔 24 h 加入MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)上清液。每孔加 150 μL DMSO，振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分融解。比色：選擇 490 nm 波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 ASCs表面特異性蛋白

取P3代脂肪干細(xì)胞，消化收集細(xì)胞，1000 r/min 離心5 min，2.5%FBS/PBS 溶液重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/mL，向各樣品管中分別加入標(biāo)記的抗體，冰上避光孵育30 min，PBS 清洗3次后，流式細(xì)胞儀分析ASCs表面特異性抗原。標(biāo)記的抗體有：CD29-PE-cy7、CD45-Percp-cy5、CD90-FITC、CD105-APC 及CD11b-APC-Cy7。

1.2.4 成脂分化及鑒定

選取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以2×104細(xì)胞/cm2接種到6 孔培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達到50% ～70%，去除基質(zhì)培養(yǎng)基，加入2 mL 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A(Cyagen)繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液(Cyagen)1 d, 共誘導(dǎo)14～21 d，觀察誘導(dǎo)過程中細(xì)胞的形態(tài)變化，對照加入基質(zhì)培養(yǎng)基。油 紅O染色：吸去誘導(dǎo)液，用PBS洗2次；加入4%多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，加入去離子水清洗1次，加入60%異丙醇清洗2次。加入油 紅O染色液，染色60 min； 用去離子水洗2次，去除殘留的染色液； 加入PBS，完成染色；顯微鏡下觀察,拍照。

1.2.5 成骨分化及鑒定

選取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以2×104細(xì)胞/cm2接種到6 孔培養(yǎng)板中，24 h后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen)，每3 d換液，誘導(dǎo)周期為21 d。茜素紅(Alizarin Red)染色: Tris-HCl配制0.1%茜素紅溶液，其pH值調(diào)為4.2。吸去誘導(dǎo)液，用PBS洗2次； 加入4%多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色10 min；用PBS洗2次，去除殘留的染色液；加入PBS，完成染色；顯微鏡下觀察, 拍照。

1.2.6 3-D軟骨分化及鑒定

選取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，按2×106細(xì)胞/ mL放置于1.5 mL Ependorf 管中，蓋子用注射器針頭穿刺小孔，保持管內(nèi)能進入氣體。離心后放置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h加入0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Cyagen)，每3 d換液1次。培養(yǎng)第21天用4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，阿利新藍染色，顯微鏡下觀察并拍照。阿利新藍染色：細(xì)胞球團用PBS清洗, 4%多聚甲醛固定10 min，再用20%的葡萄糖孵化30 min，移入OCT包埋劑中室溫浸泡4 h，更換新的OCT包埋劑，室溫浸泡6 h，將標(biāo)本置于托物臺，用恒冷箱切片機切片，片厚10 μm，貼于預(yù)處理的載玻片上，-20℃冰箱保存。冷凍切片用阿利辛藍染色，反染色用核固紅。石蠟包埋切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.2.7 神經(jīng)分化及鑒定

選取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以3×104細(xì)胞/cm2接種于經(jīng)Lamnin-111 包被處理的6孔板中，加入Neurobasal培養(yǎng)基(stem cell)，培養(yǎng)基內(nèi)添加了0.5 mmol/L IBMX，10 μmol/L Foskolin, β-FGF(20 ng/mL)、EGF(20 ng/mL)、2% B27。每3 d更換新鮮誘導(dǎo)液，每周換液2次，每7～8 d傳代1次。免疫熒光： ADSCs細(xì)胞以3000細(xì)胞 / cm2密度接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被處理的24孔板，孔中放置玻片,培養(yǎng)24 h后，加入神經(jīng)誘導(dǎo)液進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)6 d后進行免疫熒光染色：先用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗1次，用0.5% Triton-X-100處理10 min，PBS洗1次，加入1% BSA封閉20 min，加一抗室溫孵育1 h， PBS洗3次，加熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS洗3次。載玻片上先加1滴DAPI封片劑，將蓋玻片從24孔板中移至載玻片上，用指甲油密封，用激光共焦顯微鏡拍攝熒光圖像。

1.2.8 總RNA提取，cDNA合成和定量PCR分析

使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)從細(xì)胞中提取總RNA，總RNA濃度由260 nm(OD260)的光學(xué)密度測定。用Super ScriptTMIII First-Strand Synthesis System(Thermo Fisher)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，-20℃?zhèn)溆谩?yīng)用SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNase H Plus)(Takara)反應(yīng)體系檢測相關(guān)基因如Nurr1、TH，每個樣品用2 μL cDNA，加入10 μL Taq Mans Gene Expression Assay kit, 6 μL 無 RNase/DNase水，25 μL 2x Taq Mans Μniversal PCR Master Mix (Applied Bio-systems),總反應(yīng)體系是 50 μL, GAPDH作內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用供應(yīng)商提供的 ABI Prism 7000 Sequence Detection Systems version 1.0 軟件系統(tǒng)，每個樣本的Ct值用每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)來確定。每個目標(biāo)基因的相對表達水平按照Taq Mans的管家基因GAPDH的Ct值來確定 (2△△Ct公式，Perkin Elmer 用戶手冊 #2)。每個樣本一式三份進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察，生長曲線，PCR干性基因檢測

新分離的細(xì)胞是多種異質(zhì)細(xì)胞的混合體，呈圓形，大小不一(圖1 A)，懸浮于基質(zhì)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后可見梭形貼壁細(xì)胞，48 h首次換液后可見貼壁細(xì)胞開始呈現(xiàn)長梭形，多角形，至72 h 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞排列密集，呈集落生長，約7 d細(xì)胞密度達80% ～90%。形態(tài)均一, 為長梭形(圖1B), MTT測定生長曲線第3代至5代結(jié)果顯示ADSCs增殖性能良好(圖2)。干細(xì)胞干性基因和細(xì)胞結(jié)構(gòu)關(guān)鍵基因PCR檢測結(jié)果(圖3)表明ADSCs表達干性基因Oct4，未表達胚胎干細(xì)胞的干性基因Nanog，Tert，Sox2；波形蛋白Vimentin負(fù)責(zé)維持細(xì)胞骨架的完整性，它對細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化具有重要作用。細(xì)胞表達基因CD13、CD45、CD59、CD105、CD166，表明所得細(xì)胞群是一個含有脂肪干細(xì)胞(ADSCs)、周細(xì)胞(pericytes)及內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的混合體。

圖3 半定量PCR檢測干性基因結(jié)果(P1)Figure 3 Semi-quantitative PCR results for stemness genes (P1 cells)

圖1 雪貂分離與傳代后的細(xì)胞形態(tài)(P1)Figure 1 The morphology of passage 1 (P1) ferret ADSCs

圖2 ADSCs增殖曲線Figure 2 Proliferation curve of the ferret ADSCs

2.2 ADSCs的表面抗原特征

細(xì)胞流式檢測結(jié)果顯示(圖4)細(xì)胞均一性較好，第一代脂肪干細(xì)胞高度表達特征抗原CD90(53.1%)，CD105(93.7%)，CD29(99.6%)，低表達CD45(28.3%)，CD11b(36.3%)。結(jié)果表明分離獲得的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特征。

2.3 誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)變化與特異性染色

成脂誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，3 d后顯微鏡下可見部分細(xì)胞胞質(zhì)中有細(xì)小的脂質(zhì)顆粒出現(xiàn)，由纖維狀細(xì)胞變成圓形細(xì)胞，并且細(xì)胞內(nèi)有多個圓形空泡；第6天起，細(xì)小的顆粒匯聚成較大的脂滴；12 d后，分化成多脂滴或單脂滴脂肪細(xì)胞，14 d后，80%的細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴，細(xì)胞核被擠向邊緣，油紅O染色結(jié)果，顯示細(xì)胞中紅染顆粒為脂滴(圖5B)。細(xì)胞兩端的突起縮短，細(xì)胞逐漸變圓。隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加脂滴數(shù)量不斷增多，油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴呈紅色，對照組呈陰性(圖5A)。

2.4 茜素紅(Alizarn Red) 染色

更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，細(xì)胞生長快速，呈現(xiàn)鱗片狀，并且連接成片，形成集落，隨后細(xì)胞呈多層生長，胞質(zhì)中出現(xiàn)絲狀或顆粒狀物質(zhì)，胞外基質(zhì)也不斷增多，細(xì)胞表面鈣鹽沉積，誘導(dǎo)21 d后鏡下觀察，已無法分辨細(xì)胞形狀，表面出現(xiàn)較多類似結(jié)節(jié)狀的結(jié)構(gòu)，茜素紅染色后鏡下可見細(xì)胞密集處有深紅色沉著物，呈長島嶼狀，并向四周放射，中心顏色明顯加深，對照組無著色鈣結(jié)節(jié)，實驗組細(xì)胞外散在出現(xiàn)鈣鹽沉積, 21 d可見細(xì)胞外有大量鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)(圖6)。

2.5 成軟骨分化

第三代的ASCs在成軟骨誘導(dǎo)3-D分化21 d后，石蠟包埋切片，阿利新藍染色可見藍色的軟骨膠原基質(zhì)(圖7)。

2.6 神經(jīng)分化

用神經(jīng)誘導(dǎo)液2 d后,細(xì)胞逐漸形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)(圖8), 6 d后的免疫熒光結(jié)果顯示部分細(xì)胞表達神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記Vimentin，神經(jīng)元樹突標(biāo)志物 Map2、NeuN(圖9)，定量PCR檢測到神經(jīng)元標(biāo)志基因TH、EN1、NURR1，以及CD44的升高(圖10)。

圖4 干性標(biāo)志物細(xì)胞表面分子CD11b、CD45、CD29、CD90、CD105的流式檢測結(jié)果Figure 4 FACS results for the stem stem cell surface markers CD11b, CD29, CD45, CD90, and CD105

圖5 脂肪樣細(xì)胞油紅O染色(×200)Figure 5 Adipocyte-like cells,oil O staining(×200)

圖6 成脂分化21 d后茜西紅染色(×200)Figure 6 Alizarin red staining after 21 d of adipogenic differentiation of the ADSCs (×200)

注：A為對照組；B為實驗組，軟骨組織染成藍色。圖7 阿利新藍與蘇木素染色(×400)Note. A is for the control group. The experimental group is on the right (B) and cartilage dyed blue.Figure 7 Adipocyte-like cells,Alcian blue and hematoxylin staining(×400)

注：A為對照組，B為誘導(dǎo)3 d后。圖8 雪貂ADSCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化對比Note. A.Control cells. B.3d after induction.Figure 8 Neural differentiation of ferret ADSCs

注：與對照組比較，* P< 0.05；與誘導(dǎo)組細(xì)胞比較，** P < 0.01。圖9 實時定量PCR檢測CD44、TH、EN1、NURR1基因表達Note. Compared with the control group, * P < 0.05. Compared with the induced cell group, ** P < 0.01.Figure 9 Real-time quantitative PCR results of the stemness gene CD44 and TH, EN1, and NURR1 expression

注：A，Map2(綠色×400)；B，NeuN(綠色×400)；C，Vimentin(綠色×630)。圖10 雪貂神經(jīng)分化6 d后的免疫熒光Note. A is Map2 (green ×400). B is NeuN (green ×400). C is Vimentin (green ×630)Figure 10 Immunofluorescence detection of the ferret ADSCs following 6 d of neural differentiation

3 討論

雪貂作為新型的實驗動物，愈加受到科學(xué)家的重視。由于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以實現(xiàn)自體的干細(xì)胞移植，目前亦被認(rèn)為是最有希望和應(yīng)用前途的干細(xì)胞來源，它也是干細(xì)胞移植的理想的種子細(xì)胞。分離并鑒定雪貂脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，為人類疾病的動物模型的干細(xì)胞治療提供同源性的干細(xì)胞，并對干細(xì)胞安全性、有效性評價提供依據(jù)具。此外，雪貂在病毒性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究及疫苗的開發(fā)應(yīng)用中可能具有重要價值。目前，分離和應(yīng)用雪貂的間充質(zhì)干細(xì)胞國內(nèi)外尚未見報道，由于目前市場上尚沒有雪貂的專用抗體，我們采用了大鼠的抗體，結(jié)果表明大鼠的抗體與雪貂有同源性也有不同，比如CD11b與CD45在理論上應(yīng)該是陰性的即小于5%，而CD90僅僅表達了53.1%，理論上表達應(yīng)該在95%以上，但是整體陽性抗體的高表達與陰性抗體的低表達的基本趨勢符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點。成軟骨分化我們采用了較為先進的3-D誘導(dǎo)方法即用細(xì)胞球進行的成軟骨分化方法。最近的文獻報道顯示與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，3-D 培養(yǎng)的細(xì)胞球在抗凋亡、多向分化、旁分泌、抗炎等多項生物功能上明顯增強，其機制與細(xì)胞骨架的改變、細(xì)胞接觸的增加和低氧微環(huán)境的刺激有關(guān)，在動物實驗中對于難愈性創(chuàng)面的修復(fù)、缺血組織的修復(fù)、組織重塑具有顯著治療效果，有廣闊臨床應(yīng)用前景[9]。ASCS成神經(jīng)分化目前在大、小鼠中雖然有報道，但是尚未見雪貂脂肪干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的報道，我們也還需要對分化的神經(jīng)元做進一步的細(xì)胞膜電位測試并證實其具有分泌功能性神經(jīng)元的功能。神經(jīng)分化培養(yǎng)液中采用的神經(jīng)誘導(dǎo)劑IBMX (3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，是胞內(nèi)cAMP降解酶磷酸二酯酶(PDE) 的非特異性抑制劑, 它可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的降解而提高胞內(nèi)cAMP水平，而第二信使cAMP 對細(xì)胞的增殖和細(xì)胞的多種功能有重要的作用，細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平增加有助于體外的細(xì)胞分化[10]。