陽(yáng)和湯對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及其Akt/mTOR信號(hào)通路的影響*

黃 芊，張扶莉，李雪蓮，尚榮國(guó)，許崇文，錢(qián)建升，竇建衛(wèi)△

1.西安市中醫(yī)醫(yī)院(西安 710021)，2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部(西安 710061),3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (西安 710061)

主題詞 乳腺腫瘤/中醫(yī)藥療法 陽(yáng)和湯/治療應(yīng)用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠

在我國(guó)，女性乳腺癌發(fā)病率已居女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位，且呈逐年上升態(tài)勢(shì)，患病年齡趨于年輕化[1]。清代王維德認(rèn)為，乳巖“初起乳中生一小塊，不痛不癢，癥與瘰疬、惡核相若，是陰寒結(jié)痰?！碧岢觥耙躁?yáng)和湯加土貝母五錢(qián)煎服”的溫陽(yáng)補(bǔ)血、散寒解凝的治療法則。由此可知，辨證為陽(yáng)虛、寒痰凝聚的乳腺癌可用陽(yáng)和湯治療，其效不差。

研究表明，蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(Protein Kinase B/the mammalian target of rapamycin，Akt/mTOR)信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的作用。在乳腺組織中，該通路的異?；罨蓪?dǎo)致乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[2]。

本研究基于Akt/mTOR信號(hào)通路，通過(guò)陽(yáng)和湯干預(yù)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，探索陽(yáng)和湯對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及其Akt/mTOR信號(hào)通路的影響。

材料與方法

1 細(xì)胞株 MDA-MB-231細(xì)胞，購(gòu)自上海和元生物技術(shù)公司。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)，SD雌性大鼠，體質(zhì)量250～300 g，12只，由西安交大動(dòng)物中心提供，使用許可：SYXK(陜)2015-002。

3 主要藥物和試劑 中藥購(gòu)于西安市雁塔區(qū)老百姓大藥房，據(jù)《中國(guó)藥典(2015版)》鑒定合格。陽(yáng)和湯煎制、濃縮、減壓干燥成浸膏，相當(dāng)于原生藥5 g/g，4℃保存。5-FU針液(規(guī)格:10 ml∶0.25 g)，上海旭東海普(國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020593)。胎牛血清(Gibco，Lot No. 1776593)，高糖培養(yǎng)基(Gibco，Lot No. 8116256)，0.25%胰酶(Gibco，Lot No. 1742078)，CCK-8試劑盒(凱基生物，Lot No. AR1160-500)，細(xì)胞凋亡試劑盒(凱基生物，Lot No. m86413)，p-Akt一抗(CST，Lot No. 9271)，p-mTOR(CST，Lot No. 9637)，Bcl-2(CST，Lot No. 9651)，bax(CST，Lot No. 9843)等。

4 主要儀器 BX 53倒置熒光顯微鏡，OLYMPUS公司；HT2型酶標(biāo)儀，Thermo公司；Labofuge臺(tái)式離心機(jī)，Heraeus公司；HC-3018超速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新；Epice-XLⅡ型顯影儀，BD公司,等。

5 實(shí)驗(yàn)方法

5.1 含藥血清的制備[3]：12只大鼠，按隨機(jī)均分為兩組(空白對(duì)照組、陽(yáng)和湯組)。陽(yáng)和湯組大鼠按18 g/kg(相當(dāng)于臨床用量20倍)的劑量灌胃給藥，空白對(duì)照組灌胃蒸餾水。各組灌胃體積按10 ml/kg計(jì)算。各組灌胃給藥每日2次(上、下午定時(shí)各1次)。連續(xù)給藥3 d，腹主動(dòng)脈取血，離心，制備血清，-80℃保存。陽(yáng)和湯高劑量含藥血清為制備血清，低劑量組含藥血清為制備血清加等量高糖培養(yǎng)基稀釋而成。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用含10%制備(含藥)血清的高糖培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞。

5.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：37 ℃，5% CO2，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基陪養(yǎng)細(xì)胞。0.25%的胰酶消化。

5.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)：取1×105/ml細(xì)胞懸液，接種到3塊96孔板上(100 μl/孔)，每板分設(shè)空白，陽(yáng)和湯低、高劑量，陽(yáng)性藥和陰性組(每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔)。24 h后，吸棄培養(yǎng)基?？瞻?，陽(yáng)和湯低、高劑量組分別用對(duì)應(yīng)血清干預(yù)，陽(yáng)性藥物組用5 μg/ml 5-Fu干預(yù)，陰性組用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基干預(yù)(200 μl/孔)。于24、48、72 h分別取出一塊板，試驗(yàn)各孔加20 μl CCK-8溶液，3 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)，計(jì)算各組平均吸光度。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=[1-(給藥組平均OD值-陰性組平均OD值)/(相對(duì)空白對(duì)照組平均OD值-陰性組平均OD值)]×100%

5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡：取對(duì)數(shù)期1×105/ml細(xì)胞懸液，接種到6孔板上，每孔2 ml，設(shè)空白，陽(yáng)和湯低、高劑量，陽(yáng)性藥物組，24 h后，吸棄培養(yǎng)基?？瞻?，陽(yáng)和湯低、高劑量組用對(duì)應(yīng)血清干預(yù)，陽(yáng)性藥物組用5 μg/ml 5-Fu干預(yù)24 h后。按照細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

5.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：細(xì)胞接種同5.4?？瞻?，陽(yáng)和湯低、高劑量組用對(duì)應(yīng)血清干預(yù)，陽(yáng)性藥物組用5 μg/ml 5-Fu干預(yù)24 h后。裂解細(xì)胞，離心，收集上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，將上清液制成上樣液，-20℃保存。電泳(上樣量20 μg/孔)，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗溶液孵育，4℃過(guò)夜。次日洗膜，二抗溶液孵育，洗膜，顯影。β-actin為參照蛋白。運(yùn)用Image J軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行定量分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)，定量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 陽(yáng)和湯對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 干預(yù)24、48、72 h后，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)和湯低、高劑量組和陽(yáng)性藥物組細(xì)胞抑制率分別均增高(P< 0.01)(圖1)。

注：與空白對(duì)照組相比，** P<0.01

2 陽(yáng)和湯對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 干預(yù)24 h后，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)和湯低、高劑量組和陽(yáng)性藥物組細(xì)胞的凋亡率均增加(P<0.01)(圖2)。

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01

3 陽(yáng)和湯對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 干預(yù)24 h后，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)和湯低、高劑量組和陽(yáng)性藥物組Bcl-2表達(dá)均降低(P<0.05或0.01)；Bax表達(dá)均增加(P<0.05或0.01)；與空白對(duì)照組相比，Bcl-2與Bax比值均降低(P<0.01)(圖3)。

注：與空白對(duì)照組相比，* P<0.05，*P<0.01

4 陽(yáng)和湯對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Akt、mTOR的影響 干預(yù)24 h后，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)和湯低、高劑量組和陽(yáng)性藥物組p-mTOR表達(dá)均降低(P<0.05或0.01)，total mTOR表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)；mTOR磷酸化率均降低(P<0.05或0.01)。干預(yù)24 h后，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)和湯低、高劑量組和陽(yáng)性藥物組p-Akt表達(dá)均降低(P<0.05或0.01)，total Akt表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)；Akt磷酸化率均降低(P<0.01)(圖4)。

注：與空白對(duì)照組相比，* P<0.05，**P<0.01

討 論

乳腺癌主因陽(yáng)氣虧虛，七情內(nèi)傷或外邪襲表以致臟腑功能失常、沖任失調(diào)，氣血瘀滯、寒痰凝聚，邪毒結(jié)聚于乳而成[4]，其病多為陽(yáng)氣虧虛、寒痰凝聚，治應(yīng)溫陽(yáng)補(bǔ)血、散寒解凝。陽(yáng)和湯重用熟地，補(bǔ)血益髓；鹿角膠，補(bǔ)腎助陽(yáng)，共為君藥。姜炭、肉桂溫?zé)?，為臣。姜炭溫中通?yáng)，肉桂溫通血脈。麻黃通絡(luò)而散寒結(jié)，白芥子祛痰，為佐。甘草生用，解毒而調(diào)諸藥，為使。全方補(bǔ)血溫陽(yáng)，化痰通絡(luò)。治療乳腺癌，標(biāo)本兼顧。

體內(nèi)、外研究表明陽(yáng)和湯具有抗乳腺癌的作用。陽(yáng)和湯可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡[5]；可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，減少NF-κB、IL-8表達(dá)[6]。陽(yáng)和湯可抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)[7]，減少CD90、MMP-9、IL-6表達(dá)[8-9]，具有抑制移植性人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用[10]。

在乳腺癌細(xì)胞中，Akt/mTOR信號(hào)通路的異?；罨?，可促進(jìn)乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移、抗凋亡和耐藥的產(chǎn)生。Akt又稱(chēng)蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)可通過(guò)多種途徑磷酸化(活化)下游靶蛋白，如Caspase-9、NF-κB、mTOR和Forkhead等[11]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可受多種細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)，而Akt是mTOR信號(hào)傳導(dǎo)的重要上游信號(hào)分子[12]，活化的Akt可直接活化mTOR。此外，活化的Akt還可抑制抑癌蛋白(The tumor-suppres-sorproteins，TSC1)與結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合蛋白(Tuber-ous sclerosis complex proteins，TSC2)結(jié)合，間接促進(jìn)mTOR活化，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡。

Bcl-2是最主要的抑制凋亡蛋白，Bax是最主要促進(jìn)凋亡的蛋白。在乳腺癌細(xì)胞中，Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)降低，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[13]。Bcl-2/Bax值增大，可抑制細(xì)胞凋亡。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)和湯可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低Bcl-2/Bax值；降低Akt、mTOR磷酸化率，抑制Akt、mTOR的活化，從而抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的活化。因此，陽(yáng)和湯治療乳腺癌的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的活化，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮抗癌作用。