氣相色譜-質(zhì)譜法無基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定冷凍韭菜中的腐霉利

許文娟，劉永強(qiáng)，丁葵英，郭禮強(qiáng)，張軒愷

（1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊261041；2.濰坊第一中學(xué)，山東濰坊261041）

腐霉利又名速克靈、速克利、殺霉利、二甲菌核利等，是一種廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，常用于韭菜等蔬菜中灰霉病的防治[1-2]。中國(guó)規(guī)定韭菜中腐霉利的最大殘留限量為0.2 mg/kg[3]，歐盟為0.01 mg/kg[4]，建立一種高效準(zhǔn)確的韭菜中腐霉利殘留量的檢測(cè)方法十分必要。

韭菜是一種復(fù)雜基質(zhì)，其中的蒜氨酸水解會(huì)產(chǎn)生一系列含有不同取代基的硫化物[5]，對(duì)檢測(cè)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)干擾，在農(nóng)殘檢測(cè)中屬于分析難度較大的基質(zhì)。對(duì)于新鮮韭菜，常采用微波消解先消除巰基的干擾，但冷凍韭菜無法進(jìn)行微波消解分散巰基，檢測(cè)難度更大。

已報(bào)道的韭菜中腐霉利的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法和光譜法[6-15]。氣相色譜-質(zhì)譜法是腐霉利檢測(cè)的常用方法，但經(jīng)常存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，使檢測(cè)結(jié)果偏高。為消除基質(zhì)效應(yīng)，使定量結(jié)果準(zhǔn)確，必須配制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正[10，16]。最常用的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB23200.8-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法》，亦采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)定量[17]。

本文以乙酸乙酯為主要試劑，對(duì)冷凍韭菜進(jìn)行提取和凈化處理，氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定腐霉利殘留量。在優(yōu)化的氣相色譜-質(zhì)譜條件下，克服冷凍韭菜復(fù)雜基質(zhì)對(duì)腐霉利檢測(cè)的強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線即可準(zhǔn)確完成定量，方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均滿足相關(guān)要求。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及傳統(tǒng)的QuEChERS方法相比，本方法操作更簡(jiǎn)單、安全，靈敏度高、成本低。料離心管中，加入乙酸乙酯40 mL，無水硫酸鈉10.0 g，均質(zhì)2 min后，以5 000 r/min高速離心8 min，上清液倒入裝有無水硫酸鈉的玻璃漏斗中，接入尖底旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋蒸濃縮至近干。

凈化：稱取5 g硅膠，正己烷濕法裝到層析柱中，上加5 g無水硫酸鈉。用2 mL乙酸乙酯溶解旋蒸瓶中蒸至近干的樣品，轉(zhuǎn)移至硅膠柱中，以25 mL乙酸乙酯分2次沖洗旋蒸瓶，轉(zhuǎn)移至硅膠柱中，滴至近干時(shí)再加25 mL乙酸乙酯洗脫。收集所有洗脫液于250 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL，過濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.1 μm）；電子轟擊離子源（EI）；升溫程序：初始 80℃，保持 1 min，以20℃/min的速率升至180℃保持3.0 min，再以20℃/min升至230℃保持4.0 min，以35℃/min升到280℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度：280℃；GC-MS接口溫度280℃；離子源溫度230℃。載氣：He，純度≥99.999%，流速：1 mL/min。進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣。選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式，定性離子 67、96、124，定量離子 283。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料

韭菜：市售。

1.1.2 儀器

Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；GM 200碾磨儀：德國(guó)RETSCH公司；IKA-T25高速分散均質(zhì)器、MS3 basic渦流混勻器：德國(guó)IKA公司；PB403-S電子天平：瑞士Mettler公司；Eppendof 5810R離心機(jī)：德國(guó)Eppendof公司；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)Heidolph公司。

1.1.3 試劑

乙酸乙酯、丙酮、乙腈、正己烷（均為色譜純）、硅膠（用前130℃烘烤10 h活化）：德國(guó)Merk；無水硫酸鈉（分析純，用前在500℃馬弗爐內(nèi)烘5 h）：天津光復(fù)科技公司；腐霉利（procymidone，CAS#32809-16-8）固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：美國(guó)Sigma公司，純度≥99%。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10 mg（精確至0.1 mg）腐霉利標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于100 mL的棕色容量瓶中，用丙酮溶解，準(zhǔn)確定容至100 mL，得100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用乙酸乙酯將腐霉利標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 步驟

提取：準(zhǔn)確稱取10.00 g韭菜樣品，置于100 mL塑

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

考察常用提取試劑乙酸乙酯、乙腈、正己烷、丙酮對(duì)冷凍韭菜中腐霉利的提取效率。以腐霉利陽性冷凍韭菜樣品為測(cè)試對(duì)象，采用國(guó)標(biāo)方法GB 23200.8-2016測(cè)定其腐霉利殘留量，以平行測(cè)定3次的平均值為該陽性樣品的腐霉利含量（C0）。分別用乙酸乙酯、乙腈、正己烷為提取溶劑，采用本文的前處理方法進(jìn)行提取，經(jīng)鋪有濾紙和無水硫酸鈉的漏斗過濾除水，收集濾液旋蒸至近干，不經(jīng)硅膠柱凈化，直接以提取試劑定容后上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算樣品中腐霉利含量（C）。二者比值為不同溶劑的提取效率，即C/C0×100%，其中提取效率的計(jì)算過程采用了回收率校正，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取試劑對(duì)冷凍韭菜中腐霉利的回收率和提取效率Fig.1 Recoveries and extraction efficiency of different reagents for procymidone in frozen leek

由圖1可見，乙腈做提取試劑時(shí)，提取效率最高（97.3%），但回收率為140.4%，超出合理范圍（80%～120%），說明乙腈提取出的冷凍韭菜中的干擾化合物具有較明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。提取效率僅次于乙腈的是乙酸乙酯，且回收率也滿足試驗(yàn)要求（95.3%）。丙酮做提取試劑時(shí)，情況和乙腈類似，提取效率高于80%，但也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，使回收率明顯高出合理范圍。以正己烷做提取試劑時(shí)，提取效率和回收率均在合理范圍內(nèi)，但均低于乙酸乙酯。

2.2 洗脫試劑的選擇

通過2.1不同試劑的提取效率對(duì)比試驗(yàn)，綜合考慮溶劑性質(zhì)及基質(zhì)效應(yīng)情況，確定采用毒性更小、效率高的乙酸乙酯為冷凍韭菜中腐霉利的提取試劑。為使整個(gè)試驗(yàn)過程溶劑使用簡(jiǎn)單化，凈化時(shí)直接嘗試乙酸乙酯洗脫，以陰性樣品添加回收試驗(yàn)的回收率及基質(zhì)效應(yīng)情況考察洗脫能力。結(jié)果表明，采用乙酸乙酯提取，硅膠柱凈化，乙酸乙酯洗脫的前處理方法，添加濃度為0.02 mg/kg～2.0 mg/kg時(shí)冷凍韭菜中腐霉利的回收率為94.7%～98.3%，基質(zhì)效應(yīng)為0.95～1.02，回收率高，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可很好的滿足試驗(yàn)要求。

因此最終確定的前處理溶劑組合為，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯洗脫，溶劑單一、毒性小，操作簡(jiǎn)單。

2.3 方法的線性、檢出限、定量限、回收率及精密度

對(duì)質(zhì)量濃度為 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μg/mL的腐霉利標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.3的條件進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，由儀器軟件以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/mL）做回歸曲線，得到線性方程y=36 637x+4.719 1，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9，結(jié)果見圖2。

圖2 腐霉利標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性曲線Fig.2 Standard curve of procymidone

以添加樣品信噪比（S/N）≥3時(shí)的空白樣品中添加濃度確定方法的檢出限（limit of detection，LOD）為0.002 mg/kg；以S/N≥10確定方法的定量限（limit of quantitation，LOQ）為0.006 mg/kg。檢出限和定量限均滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)腐霉利的殘留限量法規(guī)要求。

在空白冷凍韭菜樣品中添加不同濃度的腐霉利標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行回收率試驗(yàn)，添加水平為0.006、0.01、0.2 mg/kg，每個(gè)水平做6次平行，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表1。

表1 冷凍韭菜中腐霉利的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 1 Recoveries（Rec）and relative standard deviations（RSDs）for procymidone in frozen leek %

2.4 與傳統(tǒng)方法比較

將試驗(yàn)建立的方法與腐霉利檢測(cè)國(guó)標(biāo)方法GB 23200.8-2016及常用的QuEChERS方法[18-21]進(jìn)行比較，比較內(nèi)容及結(jié)果見表2。

表2 本方法與傳統(tǒng)方法的對(duì)比Table 2 Comparisons of this study with common methods

其中，QuEChERS方法的核心步驟為，0.1%醋酸-乙腈提取，C18、PSA凈化（美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)方法）。

基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算方法：測(cè)定腐霉利農(nóng)藥在純?nèi)軇┲械钠骄憫?yīng)值（A，n=3）、通過前處理獲得的同濃度冷凍韭菜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均響應(yīng)值（B，n=3），二者比值定義為基質(zhì)效應(yīng)因子（ME），即ME=B/A。ME=（1.0±0.1）時(shí)可忽略基質(zhì)效應(yīng)影響[22-26]。

可見，跟常用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及QuEChERS方法相比，本文建立的冷凍韭菜中腐霉利殘留量的測(cè)定方法，僅使用乙酸乙酯一種試劑，所用溶劑種類單一、毒性低。而最常用的國(guó)標(biāo)方法GB 23200.8-2016，采用乙腈、甲苯、正己烷3種試劑，且乙腈和甲苯對(duì)人體危害較大。QuEChERS方法一般使用乙腈為提取試劑，其毒性也明顯高于乙酸乙酯。從方法的定量限比較，本文建立的方法，對(duì)韭菜中腐霉利的定量限為0.006 mg/kg，采用GB 23200.8-2016及QuEChERS方法檢測(cè)時(shí)，定量限分別為0.012 6 mg/kg和0.01 mg/kg，均高于本文方法定量限。除溶劑安全、方法靈敏度高外，本方法最優(yōu)異的特點(diǎn)是可以忽略的基質(zhì)效應(yīng)。從該表看出，采用不同的方法對(duì)韭菜中的添加同濃度的腐霉利進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，采用GB 23200.8-2016及QuEChERS方法時(shí)，都有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)因子分別為1.42和1.58，定量時(shí)需用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，否則檢測(cè)結(jié)果偏高。而用本方法檢測(cè)時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)因子為0.95，接近理想情況（ME=1），可忽略基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，定量時(shí)直接采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線即可準(zhǔn)確完成。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

從當(dāng)?shù)爻小⒉耸袌?chǎng)購(gòu)入韭菜樣品10份，冷凍后制成冷凍韭菜樣品，采用本文建立的方法，檢測(cè)其中的腐霉利殘留量。本文試驗(yàn)條件下，腐霉利標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（0.7 μg/mL）、冷凍韭菜陽性樣品（2.57 mg/kg）在氣相色譜/質(zhì)譜中的選擇離子監(jiān)測(cè)（selective ion monitoring，SIM）色譜圖及提取離子色譜圖見圖3和圖4。

圖3 腐霉利標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的SIM色譜圖和提取離子色譜圖Fig.3 Selected ion monitoring chromatogram and extraction ion chromatogram of procymidone

圖4 冷凍韭菜陽性樣品的SIM色譜圖和提取離子色譜圖Fig.4 Selected ion monitoring chromatogram and extraction ion chromatogram of positive frozen leek samples

表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of practical samples

續(xù)表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Continue table 3 Detection results of practical samples

經(jīng)檢測(cè)，隨機(jī)購(gòu)買的10種韭菜樣品，有7種未檢測(cè)出腐霉利殘留，3種檢測(cè)出腐霉利殘留，但僅有一種超過國(guó)家限量要求（＜0.2 mg/kg）。將所有樣品送到某檢測(cè)公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)，相關(guān)檢測(cè)結(jié)果見表3。

可見，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，無假陰性、假陽性結(jié)果，陽性樣品的定量結(jié)果偏差很小，本文建立的冷凍韭菜中腐霉利的檢測(cè)方法定性可靠、定量準(zhǔn)確，可用于實(shí)際檢測(cè)。

3 結(jié)論

氣相色譜-質(zhì)譜法是腐霉利檢測(cè)的主流方法，但常存在基質(zhì)效應(yīng)，需要配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。冷凍韭菜在前處理之前無法通過微波消解去除巰基干擾，使最終提取液在儀器上的基質(zhì)干擾及基質(zhì)效應(yīng)更強(qiáng)。本文建立的以乙酸乙酯為主要試劑的冷凍韭菜中腐霉利的前處理方法，摒棄常用的乙腈、甲苯等高毒試劑，且最終提取液在GC/MS分析時(shí)無基質(zhì)效應(yīng)，可直接配制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，平均回收率為95.4%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.22%～3.08%，檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.006 mg/kg，優(yōu)于常用的國(guó)標(biāo)和QuEChERS方法，可滿足不同國(guó)家的殘留限量要求。