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    斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究

    2018-10-31 02:50:58李杰肖澤濤郭書賢
    食品研究與開發(fā) 2018年21期
    關(guān)鍵詞:氮源甘油油脂

    李杰,肖澤濤,郭書賢

    (南陽理工學(xué)院生化學(xué)院,河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室,河南南陽473004)

    微生物油脂(microbial lipids)又稱單細(xì)胞油脂(single cell lipid,SCO),是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭瑸樘荚?、氮源,輔以無機鹽生產(chǎn)的油脂和一些有商業(yè)價值的脂質(zhì)。微生物油脂在能源環(huán)保、食品生產(chǎn)、日用化工等方面有廣泛的應(yīng)用。在當(dāng)前人口不斷增長的情況下,對于油脂的需求量巨大,而自然資源卻日益貧乏,因此,開發(fā)新的油脂資源具有重要的現(xiàn)實意義[1-7]。

    生物柴油由于燃燒性好并且產(chǎn)生的污染少而受到許多國家的青睞,近年來,生物柴油行業(yè)急劇擴張。粗甘油是生產(chǎn)生物柴油的副產(chǎn)物,生物柴油行業(yè)規(guī)模的擴張使得副產(chǎn)物粗甘油大量產(chǎn)生。據(jù)統(tǒng)計,粗甘油副產(chǎn)物約占總產(chǎn)物量的10%,如何將粗甘油回收利用,成為了一個新的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[8-13]。

    粗甘油可作為碳源被產(chǎn)油微生物通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化為微生物油脂,相關(guān)的研究已經(jīng)取得了一定進展。2013年,Shen等研究了T.fermentans利用純甘油進行發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況,發(fā)現(xiàn)其最大的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別為4.0 g/L、1.4 g/L和35.0%[14]。2015年,Spier等對L.starkeyi利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況進行了研究,試驗表明,發(fā)酵120 h后,L.starkeyi的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別為5.74、2.89 g/L和50.49%[15]。2016年,胡洋等利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)微生物油脂的研究中,選取蛋白胨+酵母浸膏作為混合氮源,以粗甘油為碳源,通過改變氮源的含量控制培養(yǎng)基的C/N,結(jié)果表明,C/N 為 60時,T.fermentans、T.cutaneum和L.starkeyi的生物量達到最大值,分別為14.24、15.07 g/L和17.74 g/L;在C/N為110時,油脂含量達到最大值,分別為32.37%、28.55%和32.27%[16]。由此說明,菌株的生長和油脂積累對于C/N的需求是不同的。因此,本研究主要針對產(chǎn)油脂微生物,考察以粗甘油作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,不同碳氮比對其產(chǎn)油脂的影響,以期為微生物利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂提供理論和實踐依據(jù)。

    1 材料

    1.1 原料

    大豆油:南陽萬德隆超市。

    1.2 菌株

    斯達油脂酵母1809:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;斯達油脂酵母 ZW-25、MM-17、YP-07:河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室保藏。

    1.3 培養(yǎng)基

    酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YEPD)液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20,酵母膏 10,蛋白胨10,pH自然。

    YEPD固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母膏10,蛋白胨10,瓊脂粉20,pH自然。

    基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[17]:葡萄糖 70,(NH4)2SO42.0,酵母粉 0.5,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O 0.5,pH 5.8~6.0。

    粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基:根據(jù)待考察的粗甘油添加量,用粗甘油替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,其余成分同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。

    1.4 試劑

    NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4、MgCl2、CaCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4、Na2SO4、MnSO4·4H2O、KOH、NaCl、H3PO4、葡萄糖、香草醛、甲醇:均為國產(chǎn)分析純。

    酵母膏、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉:均為生物試劑。

    1.5 主要儀器設(shè)備

    LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;BSP-150電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海博迅實業(yè)有限公司;HZQ-B數(shù)顯恒溫?fù)u床:蘇州威爾實驗用品有限公司;SW-CJ超凈工作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;PHS-3C精密pH計:上海雷磁儀器有限公司;CX31生物顯微鏡:日本奧林巴斯株式會社;7890A氣相色譜儀:上海天美分析儀器有限公司。

    2 方法

    2.1 粗甘油制備

    粗甘油的制備參考孔秀梅[18],按醇油摩爾比4∶1進行酯交換反應(yīng),按油重0.32%加入催化劑氫氧化鉀,控制溫度80℃,攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后回收殘余甲醇,然后冷卻靜置。分層后收集下層液體,用50%的H2SO4調(diào)節(jié)pH值至3.0,除去皂化物,即得試驗用粗甘油。

    2.2 培養(yǎng)方法

    將保存于試管斜面的菌株活化,挑取一環(huán)接種于YEPD液體培養(yǎng)基,25℃,145 r/min培養(yǎng)48 h,作種子液。將種子液以10%接種量分別接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基,25℃、145 r/min培養(yǎng)5 d。

    2.3 高產(chǎn)油脂菌株的篩選

    設(shè)置甘油培養(yǎng)基(試驗組)和葡萄糖培養(yǎng)基(對照組),采用平板培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵的方法對斯達油脂酵母1809、ZW-25、MM-17和YP-07進行培養(yǎng),篩選出利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的高產(chǎn)菌株進行后續(xù)試驗。

    2.4 碳源、氮源對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    2.4.1 粗甘油濃度的影響

    在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的粗甘油,考察其對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響,粗甘油濃度范圍25 g/L~115 g/L,濃度梯度為15 g/L。

    2.4.2 氮源種類和濃度的影響

    固定發(fā)酵培養(yǎng)基中粗甘油濃度70 g/L,分別考察不同種類氮源對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響;考察有機氮源時固定無機氮源濃度,考察無機氮源時固定有機氮源濃度;有機氮源選擇酵母粉、蛋白胨、尿素,無機氮源選擇 NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3。

    2.4.3 碳氮比的影響

    固定發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源種類和濃度,改變粗甘油的添加量,選擇粗甘油濃度范圍25 g/L~115 g/L,濃度梯度15 g/L,分別考察不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響。

    2.5 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程研究

    將斯達油脂酵母ZW-25種子液以10%接種量接種于粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基,25℃、145 r/min培養(yǎng)144 h,每隔12小時取樣,測定菌體生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、油脂系數(shù)、pH值和殘余甘油濃度,考察菌株在發(fā)酵過程中各指標(biāo)的變化規(guī)律。

    2.6 試驗指標(biāo)的測定和計算方法

    2.6.1 生物量測定

    發(fā)酵液進行離心,將濕菌體105℃烘干至恒重,稱重。菌體生物量以g/L表示(g為干菌體質(zhì)量,L為所用發(fā)酵液體積)[19]。

    2.6.2 油脂產(chǎn)量測定(磷酸香草醛顯色法)

    分別配制濃度為 0、0.08、0.1、0.12、0.2、0.16 g/L 油脂樣品(溶劑為無水乙醇-正己烷,體積比配比為1∶2)。分別取油脂樣品各1 mL水浴蒸干后加入2 mL98%硫酸,混勻后置于90℃水浴中加熱20 min,取出在冰水浴中冷卻后,加入0.25 g/L香草醛磷酸溶液(0.025 g香草醛用1 mL無水乙醇溶解,再用34%磷酸定容到100 mL)3 mL,搖勻后室溫反應(yīng)20 min,在526 nm處測吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。菌體用無菌水洗滌兩次后適當(dāng)稀釋,取1mL菌懸液,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定油脂濃度,乘以稀釋倍數(shù)即得油脂產(chǎn)量[20]。

    2.6.3 油脂含量測定

    油脂含量/%=油脂產(chǎn)量/生物量×100

    2.6.4 油脂系數(shù)測定

    油脂系數(shù)=油脂產(chǎn)量/粗甘油消耗量×100

    2.6.5 pH值測定

    pH計預(yù)熱30 min,將電極浸入緩沖溶液進行校正,即可使用[21]。

    2.6.6 殘余甘油濃度的測定

    取5 mL丙三醇稀釋至50 mL,從中吸取0、0.8、1.6、2.4、3.2、4 mL 溶液分別加入 6 只比色管(10 mL)中,用含18%乙醇的飽和NaCl溶液定容,搖勻靜置;再分別從各比色管中吸取1.14 mL溶液加入6只裝有10 mL 5%NaOH和0.86 mL 15%CuSO4的小燒杯中,混勻后靜置10 min顯色,取適量溶液于8 000 r/min下離心5 min。然后取上清液,于630 nm波長下測定吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測發(fā)酵液用含18%乙醇的飽和NaCl溶液適當(dāng)稀釋,測其粗甘油濃度[22]。

    2.7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析

    采用酸熱法[23]提取油脂,油脂經(jīng)甲酯化后,利用氣相色譜對其脂肪酸組成和含量進行分析。

    樣品甲酯化方法參考曲威[24],取待測的微生物油脂0.1 g,加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL,于65℃水浴中皂化 30 min,加入 BF3-乙醚溶液(1 ∶1)0.2 mL,在65℃水浴中甲酯化5 min,取出,迅速冷水冷卻,加入石油醚2 mL,振蕩,靜置20 min。吸取上清液0.3μL~0.5 μL作為氣相色譜的進樣樣品。

    氣相色譜檢測條件:FFAP色譜柱,進樣口270℃,檢測器270℃;柱溫:初始溫度60℃,以8℃/min升溫至185℃,保持2 min;以2℃/min升溫至260℃保持3 min;載氣:N2;柱流速:1 mL/min;分流比 20 ∶1;進樣量1 μL。使用CHEM32軟件進行數(shù)據(jù)處理。將測得的樣品色譜圖各峰的保留時間與脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間作比較,確定樣品色譜圖各峰的性質(zhì),各組分含量(P)與不飽和脂肪酸指數(shù)(IUFA)計算如下式。

    IUFA=1×單烯酸含量/%+2×二烯酸含量/%+…+n×n稀酸含量/%

    式中:IUFA為不飽和脂肪酸指數(shù),%。

    式中:P表示組分的相對含量,%;Ai表示組分的峰面積;∑Ai表示各組分的峰面積總和。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

    甘油和磷酸香草醛顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1、圖2。

    圖1 甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glycerin

    圖2 磷酸香草醛顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of sulfo-phospho-vanillin reaction

    由圖1可知,甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=19.386x+0.001 3,曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 5。由圖2可知,斯達油脂酵母油脂標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.757 7x-0.088 2,相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 1。

    3.2 不同斯達油脂酵母菌株在粗甘油平板和葡萄糖平板上的生長情況

    將待篩選的斯達油脂酵母菌株ZW-25、MM-17、1809、YP-07分別接種在含粗甘油培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基的平板上,25℃、培養(yǎng)5 d,每天觀察并記錄兩組平板的生長情況,結(jié)果見表1。

    表1 各菌株在粗甘油平板和葡萄糖平板上的生長情況Table 1 The growth situation of different strain on crude glycerol and glucose plate

    由表1可知,4株斯達油脂酵母菌株均可在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長,菌株ZW-25在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基平板上長勢良好,說明其更適合在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長。

    3.3 不同斯達油脂酵母菌株以粗甘油為碳源發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究

    根據(jù)2.3的方法進行試驗,各菌株利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況如圖3所示。

    圖3 各菌株利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.3 The fermentation of producing lipid situation of using crude glycerol of different strain

    由圖3可知,對照組中,斯達油脂酵母各菌株的生物量和油脂產(chǎn)量均高于試驗組,說明各菌株對葡萄糖的利用程度高于粗甘油。試驗組中,菌株ZW-25的生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)與其它菌株相比均是最高的,分別為11.99 g/L、5.45 g/L、45.65%和17.27,但在對照組中,ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量低于1809和MM-17,說明菌株1809和MM-17對粗甘油的耐受程度低于ZW-25。故選擇斯達油脂酵母ZW-25作為后續(xù)試驗的菌株。

    3.4 不同粗甘油濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    根據(jù)2.4中的方法考察粗甘油濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 斯達油脂酵母ZW-25利用不同濃度粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.4 The fermentation of producing lipid situation of using different crude glycerol concentration by Lipomyces starkeyi ZW-25

    由圖4可知,斯達油脂酵母ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量隨粗甘油濃度增加而逐漸增大,當(dāng)粗甘油濃度為55 g/L時,其生物量達最大值,為14.17 g/L;而油脂產(chǎn)量在粗甘油濃度為40 g/L時達最大值6.97 g/L,且其生物量高達13.79 g/L;當(dāng)粗甘油濃度為70 g/L時,菌體生物量和油脂產(chǎn)量開始降低,可能是由于粗甘油的濃度過高而影響細(xì)胞的滲透壓。此外,粗甘油濃度為40 g/L時,菌株的油脂含量和油脂系數(shù)最高,分別為50.52%和18.12。故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂適宜的粗甘油濃度為40 g/L。

    3.5 氮源種類和濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    根據(jù)2.4中的方法考察氮源種類和濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響,結(jié)果如圖5所示。

    圖5 斯達油脂酵母ZW-25利用不同氮源發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.5 The fermentation of producing lipid situation of using different nitrogen source by Lipomyces starkeyi ZW-25

    由圖5可知,有機氮源為酵母粉時,斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的各項指標(biāo)均最高,其中生物量為13.77g/L,油脂產(chǎn)量為8.22g/L,油脂含量為59.74%,油脂系數(shù)為15.02;相比之下,在以蛋白胨為有機氮源時,其各項指標(biāo)略低;以尿素為有機氮源時,各項指標(biāo)偏低。

    對無機氮源而言,以(NH4)2SO4作為無機氮源時,斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的各項指標(biāo)均最高,其中生物量為12.04 g/L,油脂產(chǎn)量為6.13 g/L,油脂含量為50.99%,油脂系數(shù)為15.01;以NH4Cl、NaNO3、NH4NO3作為無機氮源時,其各項指標(biāo)偏低,以NaNO3為無機氮源時,其發(fā)酵產(chǎn)油脂各項指標(biāo)最低。

    故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的適宜氮源為:酵母粉+(NH4)2SO4。

    3.6 不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    根據(jù)2.4中的方法考察不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響,結(jié)果如圖6所示。

    由圖6可知,斯達油脂酵母ZW-25在低碳氮比(25~40)條件下培養(yǎng)時,菌體生長速度較快,生物量從8.91 g/L 上升至 13.79 g/L;菌株在高碳氮比(40~55)條件下培養(yǎng)時,生長速度較慢,生物量從13.79 g/L上升至14.17 g/L,但油脂產(chǎn)量較高;碳氮比為40時,油脂產(chǎn)量達6.97 g/L,說明高碳氮比利于菌株產(chǎn)油。當(dāng)碳氮比大于55時,菌株的生物量和油脂產(chǎn)量逐漸減少,可能是由于粗甘油濃度過高影響細(xì)胞的滲透壓,不利于菌株生長及產(chǎn)油。故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油的適宜碳氮比為40,經(jīng)轉(zhuǎn)換可得:粗甘油濃度為40 g/L、酵母粉 0.5 g/L、(NH4)2SO42.0 g/L。

    圖6 斯達油脂酵母ZW-25在不同碳氮比條件下發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.6 The fermentation of producing lipid situation under different carbon-nitrogen ratio by Lipomyces starkeyi ZW-25

    3.7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程研究

    根據(jù)2.5的方法對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程進行研究,結(jié)果如圖7所示。

    圖7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂各指標(biāo)的變化情況Fig.7 The change of different index of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

    由圖7可知,斯達油脂酵母ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長呈逐漸上升趨勢,144h達最大值,分別為10.03 g/L、6.07 g/L;粗甘油濃度隨發(fā)酵時間的延長逐漸降低,起始濃度從40 g/L逐漸下降至7.15 g/L;油脂含量在0~12 h上升較快,12 h達41.18%,隨后緩慢上升,到144 h達60.6%;油脂系數(shù)在0~60 h上升較快,60 h達14.12,隨后趨于平緩;隨發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵液pH值下降趨勢明顯,0~12 h,pH值從起始的5.94下降至3.96,隨后發(fā)酵液pH值緩慢下降,到144 h下降至2.41,但在發(fā)酵期間,菌體的生長未出現(xiàn)減緩的趨勢,說明菌株對發(fā)酵液pH值的變化具有較強的耐受性。

    3.8 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析

    根據(jù)2.7的方法對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成進行分析,結(jié)果如圖8和表2所示。

    由圖8和表2可知,斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂中含多種脂肪酸,其中含量最高的為油酸,其次是棕櫚酸,兩種脂肪酸占總脂肪酸的89.5%,由此可見其利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂的脂肪酸主要是以C16和C18系脂肪酸為主,可作為新的油源使用。

    圖8 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的氣相色譜圖Fig.8 The gas chromatogram of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

    表2 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析Table 2 The fatty acid composition analysis of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

    4 結(jié)論

    1)通過平板培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵的方法從斯達油脂酵母1809、ZW-25、MM-17和YP-07中篩選出利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的高產(chǎn)菌株ZW-25。

    2)碳源和氮源對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂有較大影響,培養(yǎng)基中適宜的C/N為40,適宜的碳源氮源組成為:粗甘油濃度40 g/L,酵母粉 0.5 g/L,(NH4)2SO42.0 g/L。此條件下,其生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)分別可達13.79、6.97 g/L、50.52%和18.12。

    3)斯達油脂酵母ZW-25的生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、油脂系數(shù)隨發(fā)酵時間的延長呈逐漸上升趨勢,144 h達最大值;粗甘油濃度隨發(fā)酵時間的延長逐漸降低;隨發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵液pH值下降趨勢明顯,但菌體生長未出現(xiàn)減緩趨勢,說明菌株對發(fā)酵液pH值的變化具有較強的耐受性。

    4)斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂的脂肪酸主要是以C16和C18系脂肪酸為主,其中油酸和棕櫚酸含量較高,分別為58.58%和30.92%,可作為功能性油脂的油源。

    綜上所述,斯達油脂酵母ZW-25具有利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的應(yīng)用潛力,研究結(jié)果可為粗甘油的綜合利用開辟新的途徑。

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