高效液相色譜法測(cè)定紅臀軟膏中維生素A的含量

王文郁 楊釗

紅臀軟膏為江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院生產(chǎn)的軟膏劑,用于治療和預(yù)防嬰幼兒紅臀［1-5］。主要成分為魚(yú)肝油, 維生素A為魚(yú)肝油的有效成分, 測(cè)定維生素A的含量, 可為控制紅臀軟膏的質(zhì)量以及臨床用藥提供科學(xué)參考依據(jù)［6-10］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 METTLER PL602-S電子天平；METTLER AB204-S電子天平；KH-300B型超聲波清洗器儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。

1.2 試劑 甲醇為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。對(duì)照品：維生素A醋酸酯(中檢院, Vitamln A Acetate ,批號(hào)：100368-201301, 含量：按C22H32O2計(jì), 本品每1克中含維生素A醋酸酯343 mg)。樣品：紅臀軟膏(淮安市第一人民醫(yī)院 , 批號(hào) 160801、160803、160728, 規(guī)格：20 g/支 )。魚(yú)肝油, 陰性樣品(淮安市第一人民醫(yī)院, 不含魚(yú)肝油)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜方法

2.1.1 含量測(cè)定 按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0512)測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水(90∶10)為流動(dòng)相, 柱溫為35℃, 流速為1.0 ml/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm。維生素A醋酸酯峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.1.2 測(cè)定法 精密稱取本品1 g, 置500 ml分液漏斗中,用三氯甲烷-水(5∶2)振搖提取4次, 1 ml/次, 合并三氯甲烷液, 三氯甲烷液于60℃水浴上蒸干, 殘?jiān)诱和槿芙獠⑥D(zhuǎn)移置20 ml量瓶中, 用正己烷稀釋至刻度, 搖勻, 作為供試品溶液, 精密量取10 μl注入液相色譜儀, 記錄色譜圖；另取維生素A醋酸酯對(duì)照品適量, 精密稱定, 加正己烷溶解并定量稀釋制成每1毫升中含6 μg溶液, 作為對(duì)照品溶液, 同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算, 即得。每1克中含維生素A應(yīng)為 87.72～113.52 μg。

2.2 線性與范圍 精密稱取維生素A醋酸酯對(duì)照品0.9251 g(含維生素A醋酸酯317.3093 mg)置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 精密吸取2 ml置100 ml量瓶中, 即得對(duì)照品貯備液①, 維生素A醋酸酯濃度為126.9238 μg/ml；從對(duì)照品貯備液①精密吸取25 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 即得對(duì)照品貯備液②, 維生素A醋酸酯濃度為63.4619 μg/ml；從對(duì)照品貯備液②精密吸取4 ml,置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 即得對(duì)照品貯備液③, 維生素A醋酸酯濃度為5.0769 μg/ml；分別精密量取對(duì)照品貯備液①0.5 、1、2、5、10 ml置50 ml量瓶中, 用正己烷稀釋至刻度, 搖勻。各精密量取10 μl注入液相色譜儀, 記錄色譜圖。各溶液濃度值及其峰面積見(jiàn)表1。以峰面積值(Y)對(duì)維生素A醋酸酯濃度(X)進(jìn)行線性回歸, 求得回歸方程：Y=90.079X-0.4124, R=0.9999。見(jiàn)圖1。維生素A醋酸酯在1.269～25.380 μg/ml范圍內(nèi), 峰面積值與進(jìn)樣濃度有良好的線性關(guān)系。

表1 各線性溶液濃度值及其峰面積

2.3 準(zhǔn)確度 加樣回收試驗(yàn)：采用向魚(yú)肝油與陰性樣品中加入已知量的維生素A醋酸酯對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則9101), 紅臀軟膏中維生素A醋酸酯含量約為0.01%, 回收率限度應(yīng)為85%～110%。

精密稱取魚(yú)肝油5.0434 g、陰性樣品2.4600 g, 置500 ml分液漏斗中, 加三氯甲烷-水(5∶2)振搖提取4次, 取三氯甲烷層, 合并每次三氯甲烷層, 棄去水液, 置蒸發(fā)皿中, 于60℃水浴上蒸干, 蒸干后殘?jiān)诱和槿芙獠⑥D(zhuǎn)移至50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 作為供試品溶液貯備液①。

各精密量取供試品貯備液①5 ml, 置9個(gè)50 ml量瓶中。3個(gè)量瓶一組, 每組分別加入對(duì)照品貯備液②4、5、6 ml, 用正己烷稀釋至刻度, 搖勻。按上述色譜方法測(cè)定。見(jiàn)表2。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

精密量取對(duì)照品貯備液②5 ml置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 精密量取10 μl注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)5針, 記錄色譜圖。精密量取供試品貯備液5 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 即得本底值濃度的樣品, 精密量取10 μl注入液相色譜儀, 記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2.4 專屬性 分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液(采用陰性樣品配制, 方法同供試品溶液)及正己烷溶劑各10 μl, 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖。精密量取對(duì)照品貯備液②5 ml置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 作為對(duì)照品溶液。同精密稱取魚(yú)肝油①0.2118 g、②0.2123 g分別置20 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度搖勻。魚(yú)肝油①以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：魚(yú)肝油①的維生素A醋酸酯的含量為0.5321 mg/g；魚(yú)肝油②以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：魚(yú)肝油②的維生素A醋酸酯的含量為0.5317 mg/g；魚(yú)肝油的維生素A醋酸酯的含量平均值為0.5319 mg/g。

精密稱?、亵~(yú)肝油0.1926 g, 不含魚(yú)肝油的陰性樣品0.8416 g, ②魚(yú)肝油0.1931 g, 不含魚(yú)肝油的陰性樣品0.8089 g,分別置500 ml分液漏斗中, 用三氯甲烷-水(5∶2)振動(dòng)搖提取四次, 合并每次的三氯甲烷液, 置同一蒸發(fā)皿中于60℃水浴上蒸干, 將蒸干后的殘?jiān)谜和槿芙? 并轉(zhuǎn)移置20 ml量瓶中, 加正己烷定容至刻度, 搖勻。

①魚(yú)肝油0.1926 g與不含魚(yú)肝油的陰性樣品0.8416 g混合；以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：維生素A醋酸酯的含量為0.5319 mg/g；②魚(yú)肝油0.1931 g與不含魚(yú)肝油的陰性樣品0.8089 g混合, 以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：維生素A醋酸酯的含量為0.5321 mg/g維生素A醋酸酯的含量平均值為0.5320 mg/g。

精密稱取樣品①1.4337 g、②1.4194 g(批號(hào)：160801),①0.9785 g、②0.9567 g(批號(hào)：160728)、①0.9976 g、②0.9779 g(批號(hào)：160803)分別置500 ml分液漏斗中, 用三氯甲烷-水(5∶2)振搖提取四次, 合并每次的三氯甲烷液, 置同一蒸發(fā)皿中于60℃水浴上蒸干, 將蒸干后的殘?jiān)谜和槿芙? 并轉(zhuǎn)移置20 ml量瓶中, 加正己烷定容至刻度, 搖勻。

①以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0812 mg/g；160801②以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0815 mg/g維生素A醋酸酯的含量為0.0814 mg/g；160728①以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0796 mg/g；160728②以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0801 mg/g；維生素A醋酸酯的含量為0.0798 mg/g；160803①以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0821 mg/g；160803②以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算得：維生素A醋酸酯的含量為0.0818 mg/g；維生素A醋酸酯的含量為0.0820 mg/g。供試品溶液在對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間相同處有相應(yīng)色譜峰(18.6 min), 理論板數(shù)按維生素A醋酸酯峰計(jì)為11968；陰性樣品溶液及溶劑在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)色譜峰出現(xiàn),說(shuō)明陰性樣品及溶劑無(wú)干擾。

2.5 耐用性 對(duì)照品溶液穩(wěn)定性：精密量取對(duì)照品貯備溶液①2 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 搖勻, 制成1 ml含維生素 A醋酸酯 5.0769 μg溶液, 在 0、2、4、8、24 h進(jìn)樣, 測(cè)定對(duì)照品溶液穩(wěn)定性。見(jiàn)表3。結(jié)果表明,對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

按照藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則(2015年版《中國(guó)藥典》四部通則9101)要求, 進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明, 本法準(zhǔn)確可靠, 可用于紅臀軟膏的含量測(cè)定。