流式細(xì)胞術(shù)與免疫組織化學(xué)技術(shù)在淋巴結(jié)增生性疾病中的比較研究

薛曉偉 李星奇 王德田*

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是對(duì)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析的技術(shù)，其可快速、準(zhǔn)確和客觀地檢測(cè)細(xì)胞的多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，并可進(jìn)行定量分析，同時(shí)還可對(duì)特定細(xì)胞群體加以分選[1]。FCM雖然在我國(guó)起步較晚，但近年來(lái)發(fā)展迅速，已成為研究細(xì)胞生物學(xué)的重要工具[2-4]。FCM在血液病學(xué)診斷方面具有重要的作用，尤其是流式免疫分型的應(yīng)用使白血病和淋巴瘤的診斷變得快捷和容易。對(duì)于病理科而言，在淋巴瘤的診斷中免疫組織化學(xué)技術(shù)起著舉足輕重的作用，而引入FCM是對(duì)形態(tài)診斷的提示和補(bǔ)充。本研究旨在對(duì)FCM與免疫組織化學(xué)技術(shù)在淋巴結(jié)增生性疾病中的作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集2016年12月至2017年5月北京協(xié)和醫(yī)院46例患者，其中40例為門(mén)診淋巴結(jié)腫大患者，6例為住院發(fā)熱待查患者；男性24例，女性22例；年齡14～81歲，平均年齡(37.6±3.4)歲。共采集標(biāo)本46例，分別是鎖骨上淋巴結(jié)20例，腹股溝淋巴結(jié)16例，腋窩淋巴結(jié)10例，所有經(jīng)手術(shù)切除淋巴結(jié)均為進(jìn)行固定，經(jīng)多點(diǎn)取材進(jìn)行流式檢測(cè)，剩余組織固定脫水，進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。所有患者均參照2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)造血與淋巴組織腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)診斷[5]。

1.2 儀器與試劑

(1)儀器。VIP6型全自動(dòng)組織脫水機(jī)(日本櫻花公司)；RM2235型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；CV5030型全自動(dòng)HE染色封片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；FACSAria型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，流式分析采用FACSDiva軟件；BOND型全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀(德國(guó)徠卡公司)。

(2)試劑。流式細(xì)胞法用單克隆抗體和配套試劑(美國(guó)BD公司)；免疫組織化學(xué)法用單克隆抗體和配套試劑(德國(guó)徠卡公司)。

1.3 流式細(xì)胞標(biāo)本制備及檢測(cè)

(1)標(biāo)本的保存。淋巴結(jié)標(biāo)本置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，4 ℃，保存48 h內(nèi)處理；或者置于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，即刻上機(jī)使用。

(2)單細(xì)胞懸液制備。眼科剪或手術(shù)刀柄分離組織，18 G的細(xì)針頭反復(fù)吸取，濾網(wǎng)過(guò)濾，PBS洗滌3次，懸浮于0.5～1 ml洗液備用。

(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整標(biāo)記105細(xì)胞即可，細(xì)胞濃度=細(xì)胞計(jì)數(shù)4個(gè)大格細(xì)胞數(shù)÷4×稀釋倍數(shù)×104/ml。

(4)標(biāo)記。在制備好的單細(xì)胞懸液中分別加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、(peridininchlorophyll-protein complex，PerCP)和(allophycocyanin，APC)的4種熒光素標(biāo)記的單抗[6]避光孵育20 min。

(5)洗滌。加入1 ml的PBS，以300 g離心洗滌5 min。

(6)上機(jī)檢測(cè)。棄去上清，加入PBS 200～500 μl，上機(jī)檢測(cè)。如不能及時(shí)上機(jī)，則加入同體積的1%多聚甲醛，混勻后置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，一般≤24 h。在標(biāo)記Kappa和lambda抗體時(shí)，為避免Fc受體的非特異性結(jié)合，要先用PBS洗滌待測(cè)標(biāo)本3次，離心后再標(biāo)記。

(7)參數(shù)分析。采用雙變量散點(diǎn)圖的方式對(duì)結(jié)果進(jìn)行輸出。雙變量散點(diǎn)圖包括散射光和熒光染色，即在每個(gè)雙變量散點(diǎn)圖中，設(shè)定4個(gè)區(qū)域：細(xì)胞未結(jié)合任何抗體(雙陰性)、僅結(jié)合一種抗體或結(jié)合另一種抗體(單陽(yáng)性)和結(jié)合兩種抗體(雙陽(yáng)性)的區(qū)域。

1.4 組織學(xué)檢測(cè)方法

淋巴結(jié)組織經(jīng)10%甲醛固定后，全自動(dòng)組織脫水機(jī)進(jìn)行脫水處理，包埋、制片及HE染后，鏡下診斷，對(duì)于懷疑淋巴瘤的切片進(jìn)行免疫組組化學(xué)染色分析。其中，T淋巴細(xì)胞及亞群的表面標(biāo)記物CD5、CD10和CD23均為細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 淋巴細(xì)胞系別和分化階段的判定

CD3、CD5主要表達(dá)T細(xì)胞，CD4主要表達(dá)于輔助和(或)誘導(dǎo)T細(xì)胞，CD7表達(dá)于大部分T細(xì)胞和部分NK細(xì)胞，CD8表達(dá)于抑制和(或)細(xì)胞毒性T細(xì)胞，B細(xì)胞表達(dá)CD10、CD19、CD20、cCD22及CD79α，CD56在NK細(xì)胞淋巴瘤中均高表達(dá)，CD5、CD3、CD19及CD20規(guī)則地在非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)各亞型淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組之間的差異進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

FCM技術(shù)共檢測(cè)標(biāo)本46例，其中篩選出B系淋巴瘤25例，基本正常標(biāo)本21例。

2.2 組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)分析，46例標(biāo)本中有15例為淋巴結(jié)反應(yīng)增生性疾病，1例為淋巴結(jié)結(jié)核，5例為轉(zhuǎn)移癌，25例為B系淋巴瘤。B系淋巴瘤中有14例彌漫大B淋巴瘤，6例濾泡性淋巴瘤，5例套細(xì)胞淋巴瘤。

表1 兩種技術(shù)檢測(cè)CD5、CD10和CD23抗體表達(dá)的關(guān)系(例)

2.3 FCM與免疫組織化學(xué)技術(shù)一致性對(duì)比

(1)在46例標(biāo)本中，進(jìn)行免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)并與FCM檢測(cè)有重合的標(biāo)本有40例，其中，兩種技術(shù)檢測(cè)重合的抗體主要涉及CD5、CD10和CD23，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=0.05，x2=0.05，x2=0.00；P＞0.05)，見(jiàn)表1。

(2)兩種技術(shù)檢測(cè)重合的抗體陽(yáng)性一致性比對(duì)抗體的表達(dá)如圖1、圖2所示。

圖1 免疫組化法檢測(cè)CD5示圖

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD5示圖

3 討論

FCM技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理都是抗原—抗體反應(yīng)，但是檢測(cè)的對(duì)象不同。免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)象往往是組織切片，而流式的檢測(cè)對(duì)象是活體的細(xì)胞。免疫組織化學(xué)技術(shù)需要在抗原—抗體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)，病理醫(yī)師結(jié)合鏡下結(jié)構(gòu)對(duì)顯色的結(jié)果進(jìn)行判讀。而流式細(xì)胞儀利用鞘液和氣體壓力將樣本細(xì)胞依次輸送到測(cè)量區(qū)，并在細(xì)胞受激光激發(fā)后，收集光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電子信號(hào)，量化后傳遞給計(jì)算機(jī)。由于流式細(xì)胞儀的對(duì)象無(wú)需固定、切片等步驟，因此較傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)的方法更加快捷。但是流式檢測(cè)往往在HE染色之前，存在一定的盲目性，因此初篩方案中抗體的確定就顯得尤為重要。

在本研究中采用的流式抗體初篩方案中，確定B細(xì)胞克隆性通常是診斷B細(xì)胞淋巴瘤的關(guān)鍵，因?yàn)閰^(qū)分腫瘤性過(guò)程和反應(yīng)性過(guò)程最重要的特征就是前者的克隆性，幾乎所有的腫瘤性疾病均為單克隆，而大多數(shù)良性反應(yīng)性疾病則是多克隆性[7]。確定克隆性的標(biāo)準(zhǔn)是直接或間接，對(duì)于B細(xì)胞淋巴瘤而言，其免疫球蛋白輕鏈限制性是其克隆性的最直接和可靠的證據(jù)。而FCM通過(guò)檢測(cè)B細(xì)胞Kappa和lambda輕鏈比率進(jìn)而判斷是否呈輕鏈限制性是確定B細(xì)胞克隆性最方便和有效的方法。對(duì)非腫瘤性樣本的研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞Kappa和lambda輕鏈比率通常在1∶1～2∶1范圍內(nèi)[8-11]。B細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)單克隆輕鏈，這一比率通常增大(Kappa陽(yáng)性淋巴瘤)或減小(lambda陽(yáng)性淋巴瘤)。一旦確定為B系淋巴瘤，可根據(jù)CD5、CD23、FMC-7和CD10的表達(dá)將淋巴瘤進(jìn)行分類(lèi)[12-13]。在此類(lèi)初篩方案中，雖然單克隆性是診斷B細(xì)胞淋巴瘤的必要條件，但應(yīng)注意的是，單克隆不一定是B細(xì)胞淋巴瘤，如生發(fā)中心B細(xì)胞增生、炎癥及病毒感染等導(dǎo)致Kappa/lambda比值異常的病變；與此相反，在同一標(biāo)本中如果良性反應(yīng)性B細(xì)胞較多，則實(shí)際檢測(cè)得出的Kappa和lambda比率在上述正常范圍內(nèi)，可能會(huì)掩蓋腫瘤細(xì)胞而出現(xiàn)假陰性。然而，對(duì)于上述兩種情況，可以從其他診斷線索中加以明確，如利用前向散射(forward scatter，F(xiàn)SC)及側(cè)向散射(side scatter，SSC)提供的關(guān)于細(xì)胞大小和胞漿、胞核的復(fù)雜性信息，或其他免疫標(biāo)志表達(dá)水平的改變所提供的信息，以將腫瘤細(xì)胞群與良性細(xì)胞群區(qū)分開(kāi)來(lái)，盡可能的避免正常細(xì)胞對(duì)克隆性分析結(jié)果若存在Kappa和lambda雙陰性的情況，還可能是部分腫瘤如B-淋母，本身表面免疫球蛋白輕鏈表達(dá)缺乏或減弱；或者輕鏈確實(shí)存在而流式測(cè)陰性的淋巴瘤，如彌漫大B等[14-15]。

但是，F(xiàn)CM缺乏形態(tài)學(xué)的相關(guān)證據(jù)，如經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤特征性RS細(xì)胞等無(wú)法獲得鏡下資料。此外，由于取材受限，F(xiàn)CM有可能忽略病變部位造成假陰性的情況出現(xiàn)，在本次實(shí)驗(yàn)中就出現(xiàn)了兩次假陰性的結(jié)果，雖然對(duì)診斷未造成影響，但這種情況還需要以后的流式操作中加以重視。本研究由于事先尚無(wú)相關(guān)的病理診斷信息，因此入組的標(biāo)本量少，缺乏T細(xì)胞、NK細(xì)胞及漿細(xì)胞淋巴瘤的相關(guān)數(shù)據(jù)分析，需要在日后的工作中增大樣本量進(jìn)行分析。

對(duì)于病理活檢標(biāo)本，在標(biāo)本量足、具有代表性及細(xì)胞活力好的情況下，F(xiàn)CM能夠快捷地提供淋巴瘤診斷、分型及質(zhì)量相關(guān)的所有信息，為形態(tài)學(xué)診斷提供可能的方向。鑒于目前淋巴結(jié)增生性疾病還是以形態(tài)學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)的條件下，F(xiàn)CM對(duì)于淋巴結(jié)增生性疾病的診斷更為快速，是形態(tài)學(xué)有力的補(bǔ)充。