miR-34a對脂肪干細胞移植治療跟腱炎的影響

陳巧杰， 武少坤， 鄔耀軍， 陳 良， 沈萍萍

(1寧波市第二醫(yī)院骨科， 浙江 寧波 315010； 2寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院消化內科， 浙江 寧波 315040)

跟腱炎是指跟腱急、慢性勞損引起的一種無菌性炎癥，常見于運動員和中老年患者[1-2]，其臨床癥狀以足跟部疼痛、僵硬，運動后疼痛加劇為主，不及時治療容易引發(fā)肌腱撕裂和斷裂[3]。目前，其臨床治療方法主要包括物理療法(如超聲波療法[4]、富血小板血漿療法[5]、體外沖擊波療法[6]、低水平激光療法[7]、冷凍療法[8]等)、通過手術切除跟腱周圍的炎癥組織、非類固醇抗炎藥的內服外敷等[9]。但上述治療周期相對較長，常常久治不愈，這在很大程度上與病變部位血液供應不足以及細胞代謝失常有關，嚴重地影響了患者的日常生活[10]。

近年來，骨科專家正致力于尋找一種能促進受損跟腱再生的方法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)療法以便更好地醫(yī)治跟腱炎。干細胞作為一種具有多種分化潛能的原始細胞，可在一定程度上改善受損肌腱和韌帶的再生功能。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)來源于白色脂肪細胞，具有分化成肌腱細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、內皮細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞以及心肌細胞的能力[11]。脂肪干細胞在體內能釋放出細胞因子和生長因子從而調控受損組織的重建[12]。此外脂肪干細胞還具有抗炎、促進血管再生及有助于纖維母細胞增殖的作用[13]。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA，miR)可參與調節(jié)脂肪干細胞的增殖和分化，如miR-34a在體內外高表達可促進脂肪干細胞成骨分化[14]；而Park等[15]的研究則表明miR-34a能抑制脂肪干細胞的增殖。目前脂肪干細胞越來越多被移植治療臨床疾病，如相關文獻報道脂肪間充質干細胞局部移植治療慢性腎病和慢性阻塞性肺病等[16-17]。脂肪干細胞也具有分化為肌腱細胞的潛能[18]，如果將脂肪干細胞注射到跟腱部位，是否能分化為肌腱細胞，起到治療跟腱炎作用，目前鮮有相關文獻報道。

因此，本研究旨在探討miR-34a在脂肪干細胞移植治療跟腱炎的過程中是否發(fā)揮作用及可能機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料及儀器

雌性健康SD大鼠，12周齡，體重230～270 g，購于寧波大學實驗動物中心，動物合格證編號為SCXK(蘇)2017-0007。TRIzol試劑和轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen；RIPA裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Ⅰ型細菌膠原酶購自Sigma-Aldrich；材料力學試驗機購自日本計測系統(tǒng)公司；兔抗大鼠多克?、裥湍z原(collagenⅠ)、Scleraxis (Scx)、生腱蛋白C(tenascin C,TNC)和β-actin抗體購自Abcam；SYBR? Premix Ex TaqTM逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；ECL 試劑盒和PVDF 膜購自Millipore。實時熒光定量 PCR儀購自Applied Biosystems。

2 方法

2.1人源脂肪干細胞的分離與培養(yǎng) 在無菌操作臺上，取抽脂手術患者皮下脂肪組織約2 g，剝除血管及結締組織后，眼科剪充分剪碎后，用PBS反復漂洗，除去紅細胞。加入含0.075% Ⅰ型膠原酶的PBS溶液，37 ℃消化1 h，再加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 800 r/min離心10 min，棄去上、中兩層，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、2 mmol/L谷氨酸和0.2 mmol/L抗壞血酸的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，70 μm細胞篩網(wǎng)過濾后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。患者已簽署知情同意書，所有實驗也獲得了寧波市第二醫(yī)院倫理委員會的批準。

2.2細胞轉染實驗 將生長良好的hADSCs接種到 6 孔板中，培養(yǎng)18 h左右待細胞融合度達70%～80%，方可用于轉染實驗。用無RNA 酶槍頭吸取適量miR-34a 模擬物(miR-34a mimic)和抑制物(miR-34a inhibitor)(均由GenePharma提供)，分別與Lipofectamine 2000 轉染試劑混合于培養(yǎng)基中，室溫下靜置20 min后，將轉染復合物加入6孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)基，前后輕搖細胞板使溶液混合均勻，于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，棄去原培養(yǎng)基培基，更換為 2 mL含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時設置轉染陰性對照(pre-NC)和陰性對照(negative control,NC)組。

2.3CCK-8法檢測細胞活力 取轉染后的細胞懸液接種于 96 孔板中，每孔100 μL (每孔1 000個細胞)，每組各設置5個重復。每孔沿孔壁加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2孵育1 h后，用自動酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，測定轉染24 h、48 h、72 h和96 h時細胞的活力。

2.4實驗動物分組 健康雌性SD大鼠30只隨機分為5組，每組6只，即PBS注射對照組(PBS組)、hADSCs治療組(hADSCs組)、轉染陰性對照的hADSCs治療組(hADSCs+NC組)、轉染miR-34a mimics的hADSCs治療組(hADSCs+miR-34a組)及轉染anti-sense miR-34a的hADSCs治療組(hADSCs+anti-miR-34a組)。

2.5慢病毒載體的構建 含miR-34a-mimics、 anti-miR-34a及NC的慢病毒質粒載體由GenePharma合成并包裝。將hADSCs懸液以每孔5×104接種于96孔板中，計算感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，當MOI達到50時，將10 μL預先配好滴度的慢病毒加入到各孔中，24 h后更換新鮮的培養(yǎng)基。

2.6動物模型的制備 將Ⅰ型細菌膠原酶溶解于生理鹽水中配制成15 g/L的溶液，大鼠使用麻醉機面罩給氧及2%異氟烷麻醉成功后，左下肢局部剃毛，于左后腿跟腱中心據(jù)跟骨上部10 mm處注射膠原蛋白酶溶液20 μL，構建大鼠跟腱炎模型。模型建好3 d后，在相同注射部位按動物分組分別注入PBS、hADSCs、hADSCs+NC、hADSCs+miR-34a和hADSCs+anti-miR-34a，各組注射細胞量約1×105個。術后4周頸椎脫臼法安樂死各組大鼠。切開皮膚及皮下組織，將跟腱于小腿三頭肌起點切斷，跟腱遠端包括跟骨在內，在跟骨遠端切斷。

2.7生物力學測定 將待測大鼠跟腱組織的兩端固定在材料試驗機的夾具中，在恒溫恒濕的環(huán)境中進行跟腱生物力學性能測定。測試期間不斷用生理鹽水滴浴潤濕組織，預載荷為5 N，加載速率為10 mm/s，直至跟腱在中間處斷裂為止。記錄最大載荷拉力、最大拉伸長度及壓力。跟腱硬度=最大負荷/最大拉伸長度。

2.8RT-qPCR 取待測的各組大鼠跟腱組織，剪碎后研磨成漿，利用TRIzol試劑提取組織總RNA，并逆轉錄合成cDNA，進行實時熒光定量PCR，檢測miR-34a以及hADSCs成肌腱分化標志物collagen I、Scx和TNC的mRNA表達量。以U6作為內參照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，所有實驗均重復3次。miR-34a的上游引物序列為5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3’，下游引物序列為5’-GGCAGTATACTTGCTGATTGCTT-3’； collagen I的上游引物序列為5’-CCCTGGAAAGAATGGAGATG-3’，下游引物序列為5’-CCACTGAAACCTCTGTGTCC-3’； Scx的上游引物序列為5’-GCAAGCTCTCCAAGATTGTA-3’，下游引物序列為5’-CGTCTTTCTGTCACGGTCTT-3’； TNC的上游引物序列為5’-AAAGCAGCCACCCGCTATTA-3’，下游引物序列為5’-TCAGGTTCTTTGGCTGTGGAG-3’；內參照U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.9Western blot實驗 利用RIPA裂解液，分別提取各組大鼠跟腱組織總蛋白，BCA法定量總蛋白后，取等量樣本進行10% SDS-PAGE；將凝膠上的蛋白轉膜至PVDF膜；室溫下5%脫脂奶粉封閉 1 h。再用1%脫脂奶粉稀釋collagen I、Scx和TNC抗體以及內參照β-actin抗體(1∶1 000)，孵育1 h，并于4 ℃過夜。最后在室溫下孵育辣根過氧化物酶標記的 II 抗(1∶3 000)，得到的蛋白條帶通過ECL化學發(fā)光液顯影并拍照。

3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)處理，計量資料行正態(tài)性檢驗，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析；多組樣本的均數(shù)比較先行方差齊性檢驗，方差齊者兩兩比較行SNK-q檢驗，方差不齊者行Dunnett’s檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-34a體外抑制hADSCs細胞的活力

體外分別轉染miR-34a mimic和miR-34a inhibitor后，hADSCs過表達或抑制miR-34a，CCK-8法檢測細胞活力結果顯示，轉染48 h后，與對照組相比，miR-34a過表達可顯著抑制hADSCs的活力(P<0.01)，而抑制miR-34a表達則明顯地促進了hADSCs的活力(P<0.01)，轉染后隨著時間的延長上述作用呈增強趨勢，見圖1。這表明miR-34a 在體外具有調控hADSCs活力的能力，且呈時間依賴性。

Figure 1.The viability of hADSCs was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.**P<0.01vspre-NC group.

圖1CCK-8法檢測hADSCs的活力

2 miR-34a影響hADSCs對跟腱炎模型大鼠的治療作用

5組大鼠跟腱組織的HE染色圖如圖2A所示。進一步的跟腱組織生物力學檢測發(fā)現(xiàn)，與注射PBS組大鼠相比，單獨注射hADSCs可顯著提高大鼠跟腱組織硬度(P<0.01)、壓力(P<0.01)和最大負荷拉力(P<0.01)等生物力學指標；而注射轉染miR-34a mimics的hADSCs可減弱hADSCs的治療作用；反之，注射轉染miR-34a inhibitor的hADSCs則增強hADSCs的治療作用，見圖2B～D。

Figure 2.The tendon tissues were detected by HE staining (A) and the changes of biomechanical indexes including tendon stiffness (B), stress (C) and maximum loading tension (D) were determined. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vshADSCs+NC group.

圖2大鼠肌腱組織HE染色結果及硬度、壓力和最大負荷拉力等生物力學指標

3 miR-34a影響hADSCs對跟腱炎模型大鼠的促成肌腱分化能力

RT-qPCR檢測上述5組大鼠跟腱組織中miR-34a的表達水平，與轉染對照組相比，hADSCs+miR-34a組中miR-34a的表達水平顯著增加 (P<0.01)，而hADSCs+anti-miR-34a組中miR-34a的表達水平顯著降低 (P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The expression of miR-34a was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vshADSCs+NC group.

圖3RT-qPCR檢測miR-34a表達水平

與此同時，利用RT-q PCR和Western blot檢測大鼠跟腱組織中collagen I、Scx和TNC的mRNA和蛋白表達水平。結果表明，與PBS組相比，hADSCs組collagen I、Scx和TNC的表達水平增加；與hADSCs+NC組相比，hADSCs+miR-34a組collagen I、Scx和TNC的表達降低，而hADSCs+anti-miR-34a組collagen I、Scx和TNC的表達增加(P<0.01),見圖4。

討 論

目前，對于跟腱炎的治療主要集中在物理療法，手術介入以及藥物治療等方面，這些手段雖能在一定程度上緩解癥狀，但在恢復受損跟腱組織機能方面，仍無確切效果。近年來，有報道提出利用間充質干細胞移植來取代受損及壞死組織，其在恢復肌腱功能方面有著較大優(yōu)勢[19]。但目前干細胞移植后在體內的增殖、分化情況大大限制了其在臨床上的應用。

MicroRNA是一類在轉錄后水平調控基因表達的內源性非編碼單鏈RNA。近年來多項研究顯示其具有維持細胞干性和促進細胞自我更新等的生物學功能。miR-34a作為miR-34家族的一員，具有調控正常干細胞及腫瘤干細胞增殖、分化和凋亡等作用[20-22]。本研究通過過表達和抑制miRNA-34a表達，檢測其對體外hADSCs細胞活力的影響，結果表明miR-34a過表達抑制hADSCs細胞活力，反之，抑制miR-34a表達促進hADSCs細胞活力。Park等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過抑制細胞周期相關蛋白抑制人脂肪干細胞增殖。同時還可抑制脂肪干細胞的成骨分化和成脂分化能力。與此研究結果類似，Chen等[23]發(fā)現(xiàn)，miR-34a還可通過抑制cyclin D1和CDK6等蛋白表達抑制人間充質干細胞增殖，并通過調控Jag1/Notch通路抑制人間充質干細胞向成骨細胞分化。但也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a通過調節(jié)RBP2/Notch1/cyclin D1共調控網(wǎng)絡促進人脂肪干細胞的成骨分化[14]。這些研究表明，在不同的細胞類型或培養(yǎng)條件下，以及靶向調節(jié)細胞分化中不同基因的轉錄水平，miR-34a可能發(fā)揮完全不同，甚至截然相反的作用。

Figure 4.The mRNA and protein levels of collagen I, Scx and TNC. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vshADSCs+NC group.

圖4CollagenI、Scx和TNC的mRNA及蛋白表達水平

過去，常采用骨髓間充質干細胞移植治療跟腱炎，但這樣不僅會給捐贈者帶來生理上的疼痛，而且干細胞的獲得率也相對較低[24]。本研究采用脂肪來源的干細胞，不僅取材容易，分離率也能大大提高。為探究miR-34a對在體脂肪干細胞移植治療受損跟腱組織的影響，本研究將過表達和低表達miR-34a 的hADSCs移植入跟腱炎模型大鼠體內，并檢測其生物力學各項指標，結果表明miR-34a過表達組大鼠各項指標(硬度、壓力和最大負荷拉力)均顯著降低，相反，miR-34抑制表達組各項指標均顯著升高，因此抑制miR-34a表達可以促進跟腱炎大鼠的跟腱機能修復。

本文進一步在分子水平上探討了miR-34a對脂肪干細胞的成肌腱分化能力的影響。在治療跟腱炎時，移植脂肪干細胞，誘導分化為成肌腱細胞，后者高表達成肌腱相關標志物，主要包括collagen I、 Scx以及TNC等，其中，collagen I是成熟肌腱的主要成分[25]；Scx能特異性地標記肌腱及原肌腱細胞，是肌腱細胞發(fā)育早期的特異標志物[26]；TNC在體內主要存在于肌腱組織中，使肌腱組織能夠承受一定的應力，從而實現(xiàn)相應的生物學功能[27]。我們的研究結果顯示，miR-34過表達可下調這些因子的表達；相反，抑制miR-34a表達則上調這些因子的表達。在脂肪干細胞移植治療跟腱炎時，抑制miR-34a表達可以促進肌腱分化從而有助于修復受損肌腱組織。

綜上所述，抑制miR-34a表達在體外能促進hADSCs的活力，在體內移植抑制miR-34a表達的hADSCs可促進成肌腱分化從而利于跟腱炎大鼠受損跟腱的修復。本研究為脂肪干細胞移植治療跟腱炎提供了新的研究靶點。