血漿microRNA-21水平與左室射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭相關(guān)性肺高壓的關(guān)系*

吳美華， 曾建斌， 熊向陽

(1江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科， 2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 3南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室, 江西 南昌 330006)

左心室射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)是指左室射血分?jǐn)?shù)正常，但由于心肌肥厚和間質(zhì)纖維化引起的室壁順應(yīng)性下降，使心室充盈受損，左心室舒張末壓增高、肺循環(huán)淤血、心搏量減少而出現(xiàn)臨床表現(xiàn)的一組綜合征。HFpEF相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension due to HFpEF，PH-HFpEF)是指由HFpEF引起的肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)，HFpEF患者出現(xiàn)PH與不良結(jié)局有關(guān)。微小RNA(microRNAs，miRNAs)為一種非編碼小分子RNA，通過調(diào)控基因表達(dá)，參與許多細(xì)胞的生理病理過程[1]。miRNAs穩(wěn)定存在于外周血[2-3]。在主動(dòng)脈縮窄模型，心臟成纖維細(xì)胞高表達(dá)miR-21，升高的miR-21促進(jìn)左室肥厚和纖維化，并抑制心臟成纖維細(xì)胞凋亡[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21通過上調(diào)抗凋亡的Bcl-2基因表達(dá)，抑制心肌成纖維細(xì)胞凋亡，促進(jìn)HFpEF的形成[5]。但miR-21是否與PH-HFpEF有關(guān)還不清楚。我們?cè)O(shè)想，miR-21調(diào)節(jié)心臟肥厚、纖維化和心力衰竭的機(jī)制可能同時(shí)與PH-HFpEF有關(guān)。白細(xì)胞介素6 (interleukin-6,IL-6)是一種多功能的細(xì)胞因子，有學(xué)者報(bào)道IL-6水平升高與PH有關(guān)[6]。 內(nèi)皮素(endothelin，ET)是一種含21個(gè)氨基酸的多肽，具有強(qiáng)烈的血管收縮和促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖等作用。本研究主要檢測(cè)血漿miR-21、IL-6和ET-1水平，分析其與PH-HFpEF的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

選2014年1月～2017年2月，在江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科就診的HFpEF患者，HFpEF的納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)有心力衰竭的癥狀和體征；(2)心臟(主要左心室)大小正常，且左室射血分?jǐn)?shù)>45%；(3)存在心臟結(jié)構(gòu)性改變(如左心房增大或左心室肥厚)和(或)心臟舒張功能障礙；(4)符合此類患者的人群流行病學(xué)特征，即大多為老年、女性、病因?yàn)楦哐獕夯蛴虚L(zhǎng)期高血壓病史，部分伴糖尿病或心房顫動(dòng)等；(5)腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和(或)N 末端腦鈉尿肽原輕至中度升高，至少在灰色區(qū)域。對(duì)有三尖瓣反流的HFpEF患者，通過三尖瓣反流壓差法估測(cè)肺動(dòng)脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure，PASP)。在無肺動(dòng)脈狹窄時(shí)，右心室收縮壓≈PASP=4v2+右心房壓，右心房壓根據(jù)下腔靜脈超聲特點(diǎn)確定，其中v是三尖瓣反流速度(m/s)。納入的HFpEF患者按PASP分為PH-HFpEF組(n=36，PASP≥50 mmHg)和HFpEF組(n=40，PASP<50 mmHg)，排除1、3、4、5類PH。另選年齡、性別相應(yīng)的同期健康體檢者作為對(duì)照(health control)組(n=36)。獲得知情同意書后，從肘靜脈取血以檢測(cè)miR-21等水平。

2 研究方法

2.1臨床檢測(cè) 采用Philips IE33型超聲診斷儀，探頭頻率1～5 MHz。取左側(cè)臥位，測(cè)量左心室舒張末內(nèi)徑、室間隔厚度和左心室后壁厚度、左房?jī)?nèi)徑(left atrial diameter，LAD)，根據(jù)Devereux公式計(jì)算左心室重量(left ventricular mass，LVM)，左心室重量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)=LVM/體表面積。通過化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析法測(cè)定血漿BNP水平；雙抗體夾心ELISA法測(cè)定 IL-6和ET-1水平。

2.2Real-time PCR檢測(cè)血漿miR-21水平 血漿miRNA的提取用miRNeasy Mini Kit (Qiagen)，按照說明書提取總RNA。cDNA的合成用miScript II RT Kit (50) (Qiagen)。莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物購自RiboBio。miR-21莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-GTCG-TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCATCGGATAC-GACTCAACA-3’；miR-21擴(kuò)增上游引物為5’-GTTAGCTTATCAGACTGA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；內(nèi)參照cel-miR-39序列為5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’。miScript SYBR Green PCR Kit (200) (Qiagen)檢測(cè)miRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min, 40個(gè)循環(huán)。 PCR擴(kuò)增用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，獲得Ct值，并在同一板上做無模板對(duì)照。用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-21的相對(duì)表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率表示，組間比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。miR-21與臨床資料(腦鈉尿肽和LAD等)的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析。血漿miR-21預(yù)測(cè)PH-HFpEF的準(zhǔn)確性用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析。多因素logistic回歸分析與PH-HFpEF獨(dú)立相關(guān)的危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組患者的臨床特征

PH-HFpEF組患者年齡、血漿ET-1、血漿IL-6、腦鈉尿肽和LAD均高于HFpEF組(P<0.05或P<0.01); PH-HFpEF組的LVMI與HFpEF組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性; 性別、BMI、高血壓、糖尿病、冠心病和慢性腎病等的發(fā)生率各組之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表1。

表1 PH-HFpEF組、HFpEF組及健康對(duì)照組臨床特征

PET-1: plasma endothelin-1; IL-6: interlukin-6; LVMI: left ventricular mass index; LAD: left atrial dimension; AF: atrial fibrilation; DM: diabetes mellitus; CNP: chronic nephrosis; COPD: chronic obstructive pulmonary disease; CHD: coronary heart disease; BMI: body mass index; BNP: brain natriuretic peptide; Q1: the first quartile; Q3: the third quartile.*P<0.05,**P<0.01vsHFpEF group.

2 各組患者血漿miR-21的相對(duì)表達(dá)水平

除健康對(duì)照組有2例未能檢出血漿miR-21外，其余各組均可檢測(cè)到miR-21。PH-HFpEF組的血漿miR-21水平明顯高于HFpEF組及健康對(duì)照組(分別P<0.05和P<0.01)，見圖1。

3 血漿miR-21預(yù)測(cè)PH-HFpEF的ROC曲線

以血漿miR-21水平為檢驗(yàn)變量，以HFpEF是否出現(xiàn)PH為狀態(tài)變量作ROC曲線，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積為0.80(P=0.000), 其95%可信區(qū)間為 0.703～0.897, 切點(diǎn)值為1.83，敏感性和特異性分別為77.8%和32.5%，見圖2。

4 血漿miR-21相對(duì)表達(dá)與血漿IL-6、ET-1、LAD、BNP、PH等的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，血漿miR-21與PASP (r=0.267，P=0.000)、血漿IL-6 (r=0.302，P=0.013)和 LVMI(r=0.515，P=0.036)相關(guān)，而與ET-1 (r=0.872，P=0.070)、BNP (r=0.607，P=0.52)和LAD (r=0.395，P=0.23)等無相關(guān)性。而血漿IL-6與ET-1正相關(guān) (r=0.622，P=0.002)。PASP與血漿IL-6 (r=0.36，P=0.023)、ET-1 (r=0.76，P=0.004)、BNP (r=0.43，P=0.031)及LAD (r=0.39,P=0.044)正相關(guān)。當(dāng)以HFpEF患者有或無PH為因變量(HFpEF=1，PH-HFpEF=2)，以年齡、血漿miR-21相對(duì)表達(dá)、血漿IL-6、ET-1水平、LAD、BNP、BMI、LVMI等為自變量，進(jìn)行多因素logistic回歸分析顯示，僅血漿miR-21相對(duì)表達(dá)水平、LAD和BNP與HFpEF患者出現(xiàn)PH正相關(guān)，是HFpEF患者肺高壓的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，見表2。

Figure 1.The relative expression of plasma miR-21. Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vshealthy control group;#P<0.05vsHFpEF group.

圖1各組血漿miR-21相對(duì)表達(dá)比較

Figure 2.The area under the curve (AUC) analysis of receiver operating characteristic curve for diagnosis of PH in HFpEF patients.

圖2血漿miR-21水平與HFpEF患者出現(xiàn)PH的ROC曲線

討 論

PH是HFpEF的常見合并癥，由于采用標(biāo)準(zhǔn)不同，研究報(bào)道HFpEF患者PH的發(fā)生率為50%～80%[8-9]。與1類的動(dòng)脈性肺動(dòng)脈高壓不同，PH-HFpEF屬于2類PH。在PH的發(fā)生早期可能只與被動(dòng)增加的左房壓(肺靜脈壓)有關(guān)。持續(xù)存在的肺靜脈壓升高導(dǎo)致肺靜脈和肺小動(dòng)脈內(nèi)皮損害，功能紊亂，分泌血管活性介質(zhì)失衡(縮血管物質(zhì)分泌增加而舒血管的物質(zhì)分泌減少)和肺血管結(jié)構(gòu)改變，使肺動(dòng)脈壓進(jìn)一步升高。本研究的PH-HFpEF組血漿ET-1濃度明顯高于HFpEF組，也提示升高的ET-1可使肺血管收縮，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓升高。

表2 多因素logistic回歸分析與HFpEF患者出現(xiàn)PH相關(guān)的因素

LAD: left atrial dimension; BNP: brain natriuretic peptide.

有研究表明，miR-21調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞ERK-MAP激酶信號(hào)通路，對(duì)心臟的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。在衰竭心臟的心肌成纖維細(xì)胞，miR-21表達(dá)水平升高，miR-21通過增加分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2和抑制心肌成纖維細(xì)胞凋亡而促進(jìn)心肌肥厚和纖維化，提示miR-21可能通過對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的作用而成為HFpEF的重要調(diào)節(jié)器[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，拮抗miR-21表達(dá)可改善左室肥厚和纖維化[5]。本研究檢測(cè)了HFpEF患者外周血miR-21，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道的主動(dòng)脈瓣狹窄所致的左室肥厚及肥厚型心肌病患者血漿可檢測(cè)到血miR-21升高相似[10]，HFpEF組血漿miR-21高于健康對(duì)照組，而且相關(guān)分析表明，血漿miR-21與LVMI相關(guān)。

miR-21是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/骨形態(tài)蛋白信號(hào)通路的直接靶點(diǎn)。在人類血管平滑肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和骨形態(tài)蛋白都可通過增加細(xì)胞miR-21的水平來抑制程序性細(xì)胞死亡蛋白4，從而增加收縮性基因的表達(dá)[11]。來自計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物模型的證據(jù)都表明，miR-21結(jié)合多種信號(hào)通路調(diào)控PH[12]。還有研究表明，miR-21 參與慢性缺氧引起的肺血管重構(gòu)[13]。本研究顯示，PH-HFpEF組血漿miR-21高于HFpEF組。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血漿miR-21與PASP正相關(guān)，也提示血漿miR-21升高與HFpEF患者肺高壓有關(guān)。另外，血漿ET-1、IL-6、BNP、LAD等都分別與PASP相關(guān)。為排除混雜因素的干擾，當(dāng)以HFpEF患者有或無PH為因變量(HFpEF=1，PH-HFpEF=2)，以年齡、miR-21相對(duì)表達(dá)、血漿IL-6、ET-1、LAD、BNP、BMI、LVMI等為自變量，進(jìn)行多因素logistic回歸分析顯示，血漿miR-21相對(duì)表達(dá)水平仍與HFpEF患者出現(xiàn)PH獨(dú)立相關(guān)。Wei等[14]研究也表明，與對(duì)照組比，經(jīng)右心導(dǎo)管確診的PH患者,循環(huán)miR-204、miR-21升高，并推測(cè)可能從受損的血管釋放到循環(huán)，支持本研究結(jié)果。

一些研究證實(shí)，血管平滑肌、內(nèi)皮和心臟成纖維細(xì)胞高表達(dá)miR-21，而心肌細(xì)胞是否表達(dá)miR-21，結(jié)果不一致[15-18]。Xu等[19]研究表明，心力衰竭患者竭力運(yùn)動(dòng)時(shí)，血漿miR-21表達(dá)增加。鑒于循環(huán)miRNA 表達(dá)的改變可能涉及不同機(jī)制，包括細(xì)胞釋放或轉(zhuǎn)錄的變化。 推測(cè)當(dāng)HFpEF患者病情加重，出現(xiàn)PH時(shí)，承受壓力的肺血管可能釋放更多miR-21入血，使PH-HFpEF組血漿miR-21表達(dá)增加。

IL-6 是一種多功能循環(huán)細(xì)胞因子，與機(jī)體炎癥、宿主抵抗、組織損傷的免疫作用相關(guān)，由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。 Wang等[20]報(bào)道ET-l促使大鼠血管平滑肌細(xì)胞分泌 IL-6。有研究顯示，在重度肺高壓炎癥模型，過表達(dá)人IL-6的轉(zhuǎn)基因小鼠肺織 miR-21上調(diào)6倍[21]。而L｀ffler 等[22]研究表明，IL-6可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄miR-21。本研究發(fā)現(xiàn)，PH-HFpEF組血漿IL-6水平明顯升高，而且血漿miR-21與 IL-6相關(guān),提示PH-HFpEF時(shí)升高的IL-6可能誘導(dǎo)肺組織miR-21轉(zhuǎn)錄增加，并釋放到血液中導(dǎo)致血循環(huán)miR-21升高。

最近有研究提示，miRNA 可由不同器官的某種細(xì)胞類型產(chǎn)生，可像激素樣被運(yùn)輸?shù)叫?yīng)器起作用[23]。因此推測(cè)PH-HFpEF時(shí)升高的IL-6也可能誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞釋放miR-21增加，并被運(yùn)送到肺血管在PH-HFpEF中起調(diào)節(jié)作用。

本研究進(jìn)一步ROC曲線分析還發(fā)現(xiàn)，血漿miR-21診斷PH-HFpEF的ROC曲線下面積為0.80(0.703～0.897),提示血漿miR-21或可作為PH-HFpEF的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)PH-HFpEF。

本研究的缺陷是PH-HFpEF未經(jīng)右心導(dǎo)管檢查核實(shí)，而是通過超聲估測(cè)。不過根據(jù)歐洲PH診斷指南，當(dāng)超聲估測(cè)的PASP>50 mmHg時(shí)，其準(zhǔn)確度接近右心導(dǎo)管[24]。其次，血漿miR-21與遠(yuǎn)隔臟器表達(dá)的生物學(xué)關(guān)聯(lián)還不明確，有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明，血漿miR-21與PH-HFpEF正相關(guān)，是PH-HFpEF的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，可能是PH-HFpEF的生物標(biāo)志物。但由于本研究是單中心、小樣本的研究，結(jié)果應(yīng)在多中心、大樣本的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

致謝：本研究實(shí)施過程中得到醫(yī)院信息科和病案室在資料收集方面的熱心幫助，在此一并感謝。