自噬相關(guān)蛋白在卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑治療晚期乳腺癌中的相關(guān)機制研究

譚小強 胡小輝

(上海市東方醫(yī)院吉安醫(yī)院腫瘤科，吉安343000)

乳腺癌現(xiàn)今已成為社會女性面臨的重大公共衛(wèi)生問題，主要發(fā)生在乳腺腺上皮組織，嚴重威脅女性的健康及生命，雖然其死亡率逐漸下降，但近年來在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。乳腺癌的病因尚不明確，其發(fā)生可能與家族性遺傳，環(huán)境污染或激素不當使用等因素有關(guān)[2,3]。乳腺并不是維持機體生命活動的重要器官，因此，女性原位乳腺癌并不致命；但乳腺癌細胞容易脫落，游離的乳腺癌細胞可以隨血液或淋巴液播散轉(zhuǎn)移至全身，嚴重危及女性身心健康和生命。乳腺癌臨床常采用手術(shù)切除、化療放射及靶向治療等方法，但針對晚期原發(fā)性乳腺癌的治療方法仍需進一步探究[4,5]。因此，合理準確地判斷腫瘤預后、最大化地提高個體化藥物的療效和降低化療藥物的毒副作用是當前臨床研究的重點?？ㄅ嗨麨I和奧沙利鉑作為主要的抗腫瘤化療藥物，可誘導促進乳腺癌細胞的凋亡和壞死，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到多種途徑的調(diào)節(jié)作用[6,7]，但卡培他濱和奧沙利鉑聯(lián)合應用是否可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白介導的mTOR信號通路調(diào)控誘導乳腺癌細胞凋亡，治療女性原發(fā)性晚期乳腺癌尚未見報道。本研究通過檢測乳腺癌患者活檢標本中自噬相關(guān)蛋白及mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達，旨在探討臨床上卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑對女性原發(fā)性乳腺癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1研究對象及一般資料 選取本院2015年1月～2017年1月收治的60例女性經(jīng)病理學確診的原發(fā)性乳腺癌晚期患者。平均發(fā)病年齡(49.36±4.29)歲。絕經(jīng)前29例，絕經(jīng)后31例；Luminal A型28例，Luminal B型18例，HER2陽性型11例，基底樣型3例。晚期乳腺癌診斷標準為：①腫瘤侵犯胸壁并固定；②侵犯皮膚，如皮膚潰瘍，衛(wèi)星結(jié)節(jié)，皮膚橘皮樣水腫；③炎性乳腺癌；④同側(cè)腋窩淋巴結(jié)融合成團，并與周圍組織粘連，固定；⑤患側(cè)上肢水腫；⑥乳腺癌經(jīng)手術(shù)及放療，化療再發(fā)；⑦合并有鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟、肺臟及骨等遠處器官轉(zhuǎn)移。乳腺癌的分子分型依據(jù)術(shù)中切除的腫瘤組織的免疫組化結(jié)果進行分型。本研究經(jīng)本院倫理委員會同意，患者自愿接受臨床檢查，并簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1治療方案 患者采用卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑連續(xù)治療2療程，方法：奧沙利鉑第1天和第8天按體表面積一次135 mg/(m2·d)，連續(xù)給藥4次為一療程(塞諾菲民生制藥有限公司，批號：030805，國藥準字J20050065)；卡培他濱第1～14天1 000 mg/m2口服2次/d，21 d為一療程(連云港潤眾制藥有限公司，批號：H20123425，國藥準字H20123425)。

1.2.2觀察指標 依據(jù)實體瘤療效評價標準(RECIST)評定化療藥物的臨床療效。在化療前后1周內(nèi)分別測量患者乳房腫塊的大小及雙腋雙鎖骨上淋巴結(jié)等轉(zhuǎn)移情況，用于評估化療療效。分為①完全緩解(Complete remission,CR)：腫瘤持續(xù)1個月完全消失；②部分緩解(Partial remission,PR)：腫瘤持續(xù)1個月體積縮小≥30%，且無其他病變擴展；③穩(wěn)定(Stable disease,SD)：腫瘤持續(xù)1個月體積增大≤20%，體積縮小≤30%；④進展(Progressive disease,PD)：腫瘤體積增大≥20%。患者應在4周后重新測量腫瘤病灶，仍達CR、PR和SD標準者方可最后評定為CR、PR和SD。其中有效=完全緩解+部分緩解，無效=穩(wěn)定+進展。

1.2.3免疫組織化學法檢測與免疫染色定量 取乳腺癌患者的病理石蠟切片標本，室溫封閉40 min(5%血清)，加入單克隆抗體mTOR(#2983，Cell Signaling)和LC3-Ⅱ(#3868，Cell Signaling)，堿性磷酸酶二抗(#8681，Cell Signaling)4℃孵育。PBS清洗后加入SP和DAB恒溫顯色封片。用10×、40×物鏡顯微鏡進行觀察。應用ImagePro Plus對免疫組化結(jié)果進行分析，并按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱評分(Immunohistochemical scores，IHS)。IHS=a×b，a代表陽性細胞百分比：a=0，無陽性細胞；a=1，陽性細胞為1%～10%；a=2，陽性細胞為11%～50%；a=3，陽性細胞為51%～80%，a=4，陽性細胞所占比例達81%以上。b代表陽性細胞染色強弱：b=0，陰性；b=1，弱陽性；b=2，中度陽性；b=3，強陽性。

1.2.4Real-Time PCR檢測mTOR、LC3-II、Beclin-1、p62和Atg5 mRNA表達含量 采用Real-time PCR法對mTOR、LC3-II、Beclin-1、p62和Atg5 mRNA表達進行檢測。Trizol法提取乳腺癌組織中的總RNA，轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行Real-time PCR操作。實驗采用閾值循環(huán)數(shù)(Cycle threshold,CT)相對定量法，計算不同基因mRNA的表達含量。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。PCR所用引物序列如下：mTOR上游引物5′-CAGTTGCCCAGTGGACTGAAG-3′、下游引物5′-GCTGGTCATAGAGCCGAGAC-3′;LC3-Ⅱ上游引物5′-CAATCACCCTGAGGGAACA-CAACA-3′、 下游引物5′-ATCTGCCTCCACTGG-TCAATGGA-3′；Beclin-1上游引物5′-TCTCGCCTCCTAGCTTATTATAACC-3′、下游引物5′-GATTCGGCACTTCAGGAGCTT-3′；p62上游引物5′-GACTGCGCCTCCTGCGTCTT-3′、下游引物5′-AGCCCGCGGAGGGTCTACAT-3′；Atg5上游引物5′-CCCTACACGAAGCACCAGACACT-3′、下游引物5′-GCGGGCCCTGGAGATTCATC-3′。

1.2.5Western blot檢測蛋白mTOR、LC3-II、Beclin-1、p62和Atg5含量 取乳腺癌組織冰上裂解2 h，并測量蛋白濃度。常規(guī)恒流進行電泳和轉(zhuǎn)膜，按稀釋比例加入mTOR(#2983，Cell Signaling)、LC3-Ⅱ(#3868，Cell Signaling)、Beclin-1(#4747，Cell Signaling)、p62(# 23214，Cell Signaling)和Atg5(# 9980，Cell Signaling)一抗和二抗(#4418、#4410，Cell Signaling)。用ECL顯色劑顯色，對各組蛋白泳道條帶進行灰度掃描分析，計算得出mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和Atg5蛋白表達量。

1.2.6抗腫瘤免疫功能特征檢測 采集患者治療前后清晨空腹血，使用流式細胞術(shù)檢測患者血液內(nèi)T 淋巴細胞亞群及 NK 細胞。CD3+、CD4+、CD8+、CD16+/CD56+分別代表 T細胞、TH細胞、TS細胞和NK 細胞(單克隆抗體和流式細胞儀美國 Becton Dickinson 公司產(chǎn)品)。

2 結(jié)果

2.1療效診斷 經(jīng)RECIST標準評價卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療療效的患者療效情況，其中化療有效為34例(56.67%)，無效為26例(43.33%)，說明卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療療效顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=10.385，P=0.001)。

2.2腫瘤免疫功能特征檢測 與化療前患者血清中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+/CD56+表達量相比，卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療后乳腺癌血清中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD16+/CD56+表達量顯著升高，CD8+含量顯著降低，具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表2。

表1卡培他濱和奧沙利鉑化療療效

Tab.1CapecitabineandOxaliplatinChemotherapy

Groupsn(+)(-)χ2PEffective3462810.3850.001Noneffective261511

2.3mTOR和LC3-Ⅱ免疫組織化學結(jié)果 圖1，乳腺癌患者應用卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療前后mTOR和LC3-Ⅱ蛋白免疫組化染色強度具有明顯的差異(P<0.05)?？ㄅ嗨麨I聯(lián)合奧沙利鉑化療后乳腺癌組織中mTOR顯著降低，LC3-Ⅱ顯著升高差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4mTOR和LC3-Ⅱ的蛋白表達水平 對mTOR和LC3-Ⅱ蛋白免疫組化結(jié)果進行分析，與化療前乳腺癌組織中的蛋白表達量相比，卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療后乳腺癌組織中mTOR蛋白表達含量顯著降低，LC3-Ⅱ蛋白表達含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 免疫組織化學檢測結(jié)果(×400)Fig.1 Immunohistochemistry results(×400)

IHSmTOR proteinexpressionLC3-Ⅱ proteinexpressionPre-chemotherapy9.783±0.2182.548±0.362Post-chemotherapy3.145±0.1691)7.314±0.4171)

Note：Compared with the protein content before chemotherapy,the difference was statistically significant，1)P<0.05.

GroupsCD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+CD16+/CD56+Pre-chemotherapy64.358±6.12528.976±3.12533.620±4.2161.078±0.02716.209±1.128Post-chemotherapy69.783±6.2311)34.536±3.2611)25.751±4.1131)1.525±0.0331)21.094±1.0351)

Note：Compared with the protein content before chemotherapy,the difference was statistically significant，1)P<0.05.

圖2 乳腺癌組織中mRNA的表達Fig.2 mRNA expression in breast cancer tissuesNote: Compared with the mRNA level of breast cancer pre-chemotherapy,the difference was statistically significant，*.P<0.05.

圖3 蛋白含量檢測結(jié)果Fig.3 Protein content test resultsNote: Compared with the protein level of breast cancer pre-chemotherapy,the difference was statistically significant,*.P<0.05.

2.5mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和Atg5 mRNA表達含量 與化療前乳腺癌組織相比，卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療后乳腺癌組織中mTOR和p62 mRNA表達含量顯著降低，LC3-Ⅱ、Beclin-1和Atg5 mRNA表達含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，圖2。

2.6mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和Atg5蛋白含量檢測結(jié)果 圖3，與化療前乳腺癌組織相比，卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療后乳腺癌組織中mTOR和p62 蛋白表達含量顯著降低，LC3-Ⅱ、Beclin-1和Atg5蛋白表達含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

卡培他濱是新一代應用于抗腫瘤的氟尿嘧啶類化合物，口服經(jīng)腸黏膜迅速吸收及活化，在肝臟被羧基酯酶轉(zhuǎn)化為無活性的中間體5′-脫氧-5′氟胞苷，在胞苷脫氨酶的作用下于肝臟和腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為5′-脫氧-5′氟尿苷，最后經(jīng)過胸腺嘧啶磷酸化酶催化在腫瘤細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?5-Fu[8,9]。由于腫瘤組織中胸腺嘧啶磷酸化酶活性顯著高于正常組織，因此卡培他濱在腫瘤部位具有更高的活性，對化療不敏感的缺氧區(qū)域活性更高，毒副作用相對較小[10,11]。奧沙利鉑屬于第三代鉑類抗癌藥，是細胞周期非特異性藥物，其抗癌譜和主要作用機制與其他鉑類藥作用機制類似，主要是以腫瘤細胞內(nèi)DNA為靶作用部位，形成鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)阻斷拮抗DNA合成，從而產(chǎn)生細胞毒和抗腫瘤活性[12,13]。研究表明，奧沙利鉑對人多種腫瘤細胞均有抑制作用和抗瘤活性，與氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合應用具有協(xié)同作用，毒副反應較輕[14,15]。

機體的免疫及腫瘤免疫主要由 T 淋巴細胞介導，CD3+T淋巴細胞代表總T淋巴細胞。根據(jù)其表面標志和分化抗原的不同，可以將 T 細胞分為CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞，其中CD4+T細胞可以分泌大量細胞因子輔助CD8+T 細胞及 NK 細胞殺傷腫瘤，具有免疫記憶和直接殺傷腫瘤細胞的功能[16]。CD8+T抑制性 T 淋巴細胞，具有抑制體液和細胞免疫的功能。正常情況下，CD4+/CD8+細胞處于動態(tài)平衡狀態(tài)，正常人比值基本恒定在1.5～2.5，乳腺癌惡性腫瘤患者因 T 淋巴細胞數(shù)量減少、功能不全、CD4+/CD8+比例失調(diào)，從而出現(xiàn)患者機體細胞免疫功能低下[17]。NK 細胞是機體天然免疫的主要承擔者，具有細胞毒性效應，可以直接殺傷腫瘤細胞、病毒感染細胞及移植的組織細胞和進行免疫調(diào)節(jié)，是免疫應答中最早發(fā)揮作用的效應細胞及人體抗腫瘤和抗感染的第一道防線，人類 NK 細胞主要為 CD16和 CD56 陽性[18]。本研究表明，給予乳腺癌患者卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療后，患者體內(nèi)CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD16+/CD56+表達量顯著升高，CD8+含量顯著降低，說明卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑可有效調(diào)節(jié)腫瘤患者體內(nèi)的免疫應答過程，有效發(fā)揮抗腫瘤作用。

細胞自噬可以通過與細胞生長、增殖、存活和死亡相關(guān)的多種信號傳導途徑誘導和加速腎小管上皮細胞的損傷和死亡[19,20]。LC3作為自噬激活的主要細胞學標志，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，主要由AMPK/mTOR 信號通路調(diào)控。Beclin1是一種抑癌基因，是酵母自噬基因Atg6/Vps30 的同源基因，依靠beclin1-PI3KC3復合體參與自噬體的形成，p62是SQSTMI編碼的泛素結(jié)合蛋白，也是自噬的選擇性底物之一，其參與泛素蛋白酶系統(tǒng)和自噬相關(guān)蛋白降解，也在介導細胞信號轉(zhuǎn)導、蛋白更新和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程參與[5,6]。Atg5-Atg12-Atg16復合物也通過組分解離而促進吞噬細胞發(fā)育[21,22]。mTOR 激酶作為自噬的主要信號通路調(diào)節(jié)劑，在富含氨基酸和生長因子等營養(yǎng)充足的情況下，mTOR在細胞內(nèi)被激活并阻斷自噬通路；在細胞處于饑餓環(huán)境或營養(yǎng)缺乏的情況下，mTOR在細胞內(nèi)活性被抑制，反向調(diào)節(jié)細胞自噬通路[23,24]。卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑激活自噬通路可能的機制有：①通過抑制AMPK/mTOR表達以激活自噬通路[25]；②通過下調(diào)p53/bnip3信號通路以激活自噬通路[26]；③誘導wnt/β-catenin信號通路，實現(xiàn)對自噬水平的負性調(diào)節(jié)[27]。

本研究結(jié)果表明，乳腺癌患者應用卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑化療后，總有效率為56.67%，療效顯著。免疫組化、Western blot和Real-Time PCR結(jié)果表明，給予乳腺癌患者應用卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑治療后，乳腺癌患者體內(nèi)mTOR和p62 mRNA表達和蛋白含量顯著降低，LC3-Ⅱ、Beclin-1和Atg5 mRNA表達和蛋白含量顯著上升，說明應用聯(lián)合藥物化療后，患者體內(nèi)由mTOR和LC-3Ⅱ介導的自噬通路被激活，在乳腺癌細胞的增殖和凋亡過程中起到重要作用，參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑可有效控制乳腺癌的疾病發(fā)生，產(chǎn)生一定的臨床治療作用。自噬相關(guān)蛋白及mTOR信號通路與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和治療效果密切相關(guān)，可以有效作為乳腺癌的治療新靶點。