不同流行區(qū)間日瘧原蟲疫苗候選抗原pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域的種群結(jié)構(gòu)分析①

何 洋 孫 林 曹雅明 朱曉彤

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，沈陽110122)

間日瘧原蟲是非洲以外地區(qū)，亦是我國流行最為廣泛的瘧原蟲種屬，世界范圍內(nèi)25億人口受間日瘧原蟲感染威脅[1]。近二十年來，有效的全球瘧疾防控措施已使惡性瘧原蟲發(fā)病率逐年下降，但由于對(duì)致病力和致死力較弱的間日瘧原蟲重視程度不足，致使間日瘧原蟲的新藥和疫苗研制嚴(yán)重滯后于惡性瘧原蟲，由此導(dǎo)致間日瘧原蟲感染所致瘧疾發(fā)病人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[2]。相較于已進(jìn)入Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)的多種惡性瘧原蟲候選抗原，迄今僅有兩種間日瘧原蟲疫苗候選抗原進(jìn)入Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)。因此，間日瘧原蟲疫苗的研發(fā)迫在眉睫[3]。

瘧原蟲頂端膜抗原-1(Apical membrane antigen 1,AMA1)存在于多種瘧原蟲種屬和頂復(fù)門原蟲，為惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲理想的疫苗候選抗原[4]。AMA1為分子量83 kD的Ⅰ型跨膜蛋白，蛋白結(jié)構(gòu)域中包含信號(hào)肽、半胱氨酸富含區(qū)、跨膜區(qū)和保守的胞內(nèi)區(qū)[4]。AMA1的胞外區(qū)由半胱氨酸殘基組成的二硫鍵分為3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(Domain Ⅰ-Ⅲ,DⅠ-DⅢ)[4]。由于AMA1蛋白在裂殖子侵襲宿主紅細(xì)胞和子孢子侵襲肝細(xì)胞過程中均發(fā)揮重要作用，以AMA1為基礎(chǔ)的瘧疾疫苗通過干擾瘧原蟲生長發(fā)育中的兩個(gè)關(guān)鍵階段，可顯著提升抗瘧疫苗的保護(hù)性作用[5]。

多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲ama1基因(pfama1和pvama1)的DⅠ區(qū)域多態(tài)性程度高于DⅡ和DⅢ區(qū)域，且在進(jìn)化過程中經(jīng)歷陽性選擇，提示此區(qū)域?yàn)樗拗髅庖呦到y(tǒng)識(shí)別的抗原靶位，具有良好的免疫原性[6,7]。以ama1為基礎(chǔ)的疫苗研制，除明確pvama1基因編碼蛋白的強(qiáng)免疫原性區(qū)域外，了解世界范圍內(nèi)不同流行區(qū)中pvama1基因各主要單倍體型頻率和其地域分布特點(diǎn)，有助于開發(fā)覆蓋世界范圍內(nèi)ama1基因多態(tài)性的廣泛有效疫苗。而疫苗相關(guān)抗原的種群結(jié)構(gòu)分析，可預(yù)測(cè)介導(dǎo)抗原多樣性的多態(tài)位點(diǎn)并明確抗原多樣性的地理分布趨勢(shì)，因此在疫苗研制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

本研究主要探討云南省中緬邊境流行區(qū)pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的世界范圍內(nèi)其他3個(gè)主要間日瘧原蟲流行區(qū)pvama1基因的序列數(shù)據(jù)，通過基因多態(tài)性、中性檢驗(yàn)和種群結(jié)構(gòu)分析，闡明pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域的單倍體型多樣性及其地域分布特點(diǎn)，旨在為研制廣泛有效的pvama1疫苗提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(9765，TaKaRa，日本)；TaKaRa MiniBET Agarose Gel DNA Extraction Kit(9762，TaKaRa，日本)；PrimeSTAR?Max DNA Polymerase(R045A，TaKaRa，日本)；Agarose Regular(5260，TaKaRa，日本)；DL 1 000 DNA Marker(3591A，TaKaRa，日本)；10 × Loading Buffer(9157，TaKaRa，日本)。

1.2方法

1.2.1流行區(qū)樣本基因組DNA提取 依據(jù)TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(9765，TaKaRa，日本)試劑盒說明書所示，提取2013年云南省中緬邊境地區(qū)采集的間日瘧原蟲感染患者指尖血制備的干濾紙片間日瘧原蟲基因組DNA。

1.2.2中緬邊境流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域的PCR擴(kuò)增和測(cè)序 采用pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域的特異性擴(kuò)增引物：pvama1_F：5′-CCTACCGTTGAGAGAAGCACA-3′和pvama1_R： 5′-GCATTTTTTATCCCAATCATTACG-3′擴(kuò)增pvama1基因DⅠ區(qū)[堿基位點(diǎn)(nucleotide position,nt) 280～741 bp；氨基酸位點(diǎn)(amino acid position,aa)94～247]。20 μl的PCR反應(yīng)體系包含10 μl 的PrimeSTAR Max Premix(2×)，各0.5 μl 的10 μmol/L上游和下游引物和1.0 μl基因組DNA 模板。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，56℃ 15 s，68℃ 90 s(45個(gè)循環(huán))；68℃延伸5 min 4℃保存。采用1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)特異性PCR產(chǎn)物。特異性PCR產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa MiniBET Agarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒純化后送華大基因測(cè)序(北京)，測(cè)序引物同PCR引物。

1.2.3間日瘧原蟲世界范圍內(nèi)不同流行區(qū)pvama1基因的多態(tài)性分析和中性檢驗(yàn) 選用Sal-I標(biāo)準(zhǔn)株(GenBank序列號(hào)：AF063138)的pvama1基因D Ⅰ 結(jié)構(gòu)域(nt:280～741 bp)為標(biāo)準(zhǔn)序列，以MEGA7.0軟件比對(duì)分析云南省中緬邊境地區(qū)(China，樣本例數(shù)n=16)、韓國(Korea，n=4)、泰國(Thailand，n=13)和巴布新幾內(nèi)亞(PNG，n=9)流行區(qū)pvama1基因序列[8-10]。采用DnaSP6.10.1軟件計(jì)算分離位點(diǎn)數(shù)目(The number of segregating sites,S)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,π)、單倍型(The number of haplotypes,H)和單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd)[11]。采用DnaSP6.10.1軟件分析pvama1基因DⅠ 區(qū)域的非同義核苷酸置換率dN和同義核苷酸置換率dS比值，及Tajima′sD*檢驗(yàn)值和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4間日瘧原蟲世界范圍內(nèi)不同流行區(qū)pvama1基因DⅠ的群體結(jié)構(gòu)分析 采用Structure2.3.2軟件[12,13]，通過貝葉斯算法分析，以明確世界范圍內(nèi)間日瘧原蟲不同流行區(qū)中pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域具有“相似性抗原表位”的單倍體型亞群及其地理分布趨勢(shì)。貝葉斯算法基于各種群共有的等位基因頻率，將相似單倍體型分組成先驗(yàn)假設(shè)的亞群數(shù)(K)。使用20 000次測(cè)試迭代周期重復(fù)運(yùn)行Structure后，進(jìn)行1 200 000次馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)迭代運(yùn)算，從而估計(jì)亞群數(shù)目。所有運(yùn)算均基于混合模型。先驗(yàn)假設(shè)對(duì)K值為2至4進(jìn)行10次重復(fù)運(yùn)算，獲取運(yùn)算結(jié)果后，導(dǎo)入Structure Harvester軟件(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harve st/)，計(jì)算LnP(K)和ΔK參數(shù)，預(yù)測(cè)最優(yōu)K值[14]。采用CLUMPP軟件進(jìn)行重復(fù)抽樣分析[15]。通過Distruct1.1軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)的聚類分析繪圖。

2 結(jié)果

2.1樣本采集和間日瘧原蟲流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域基因多態(tài)性分析 本研究采用pvama1基因DⅠ區(qū)域特異性引物，成功擴(kuò)增2013年采集于云南省中緬邊境間日瘧原蟲流行區(qū)的16例樣本(圖1)。結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的韓國(Korea)、泰國(Thailand)和巴布新幾內(nèi)亞(Papua New Guinea，PNG)等間日瘧原蟲流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域序列結(jié)果，采用DnaSP6.10.1軟件進(jìn)行的基因多態(tài)性分析顯示：中國云南省、韓國、泰國和巴布新幾內(nèi)亞等流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域(nt:280～741 bp;codon:94～247 aa)多態(tài)性位點(diǎn)(S)數(shù)目分別為：24、11、25和18；核苷酸多態(tài)性(π)分別為0.015、0.013、0.021和0.018；單倍型(H)分別為16、4、13和9；單倍型多樣度(Hd)均為1.000(表1)。

圖1 云南省中緬邊境間日瘧原蟲流行區(qū)采樣地點(diǎn)Fig.1 Sampling sites in Plasmodium vivax endemic areas of China-Myanmar border area in Yunnan provinceNote:Red dots represent sampling sites of P.vivax infected samples.

表1間日瘧原蟲不同流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域多態(tài)性分析

Tab.1GeneticdiversityofDⅠofpvama1geneinP.vivaxendemicareas

PopulationsnSπHHdChina16240.015161.000Korea4110.01341.000Thailand13250.021131.000PNG9180.01891.000

Note：S.Number of polymorphic (segregating) sites;π.Pairwise nucleotide diversity;H.Number of haplotypes;Hd.Haplotype diversity.

2.2間日瘧原蟲不同流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域dN/dS檢驗(yàn)分析 采用DnaSP6.10.1軟件中sliding window plot分析方法對(duì)間日瘧原蟲云南省中緬邊境地區(qū)、韓國、泰國和巴布新幾內(nèi)亞流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域進(jìn)行的dN/dS分析結(jié)果顯示：云南省中緬邊境地區(qū)pvama1基因(nt:376～403 bp)，泰國間日瘧原蟲流行區(qū)pvama1基因(nt:367～667 bp)和巴布新幾內(nèi)亞間日瘧原蟲流行區(qū)pvama1基因(nt:367～379 bp)的dN/dS比值顯著大于1(P<0.05)，提示pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域中上述區(qū)域在進(jìn)化過程中經(jīng)歷陽性選擇，如圖2。

2.3間日瘧原蟲不同流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域Tajima′sD*檢驗(yàn) 如圖3所示，中緬邊境地區(qū)、 韓國、泰國和巴布新幾內(nèi)亞流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域進(jìn)行的Tajima′sD*檢驗(yàn)結(jié)果，中緬邊境地區(qū)pvama1基因nt:325～379 bp和nt:616～634 bp；韓國間日瘧流行區(qū)pvama1基因nt:418～526 bp；泰國pvama1基因nt:325～610 bp和nt:625～697 bp；巴布新幾內(nèi)亞流行區(qū)pvama1基因nt:325～478 bp和nt:640～697 bp的Tajima′sD*檢驗(yàn)值均大于0，且巴布新幾內(nèi)亞流行區(qū)pvama1基因nt:640～697 bp顯著大于1(P<0.05)，提示pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域中上述區(qū)域在進(jìn)化過程中經(jīng)歷陽性選擇。

圖2 間日瘧原蟲不同流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域dN/dS檢驗(yàn)分析Fig.2 dN/dS analysis of pvama1 gene DⅠ domain in P.vivax endemic areasNote:nt position.Nucleotide positions;China.China-Myanmar border area;PNG.Papua New Guinea.

圖3 間日瘧原蟲不同流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域Tajima′s D*檢驗(yàn)的sliding window plot分析Fig.3 Sliding window plots of Tajima′s D* test of pvama1 gene D Ⅰ domain in P.vivax endemic areasNote:Thailand-Sign (green dot) marked regions show P<0.1;PNG-Sign (black diamond) marked regions show P<0.05.

圖4 Pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域單倍體型群體結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Clustering patterns of pvama1 gene DⅠ domainNote:Structure analysis of pvama1 gene DⅠ domain haplotypes from P.vivax endemic areas.China.China-Myanmar border area (n=16);Korea.P.vivax endemic area in Korea (n=4);Thailand.P.vivax endemic area in Thailand (n=13);PNG.P.vivax endemic area in Papua New Guinea (n=9).

2.4世界范圍內(nèi)間日瘧原蟲不同流行區(qū)pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域中不同單倍體型群體結(jié)構(gòu)分析 為明確pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域各單倍體型在世界范圍內(nèi)不同流行區(qū)分布情況和亞群組成，我們采用Structure軟件對(duì)pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域單倍體型進(jìn)行聚類分析。通過分析LnP(K)和ΔK參數(shù)，檢測(cè)出最佳K值為3(圖4A、B)。聚類分析結(jié)果顯示，世界范圍內(nèi)不同流行區(qū)pvama1基因DⅠ結(jié)構(gòu)域單倍體型可分為3個(gè)亞群，主要單倍體型不均勻分布于4個(gè)選取的流行區(qū)。其中韓國pvama1基因群體結(jié)構(gòu)顯著區(qū)別于中國云南省中緬邊境、泰國和巴布新幾內(nèi)亞流行區(qū)，提示韓國流行區(qū)的主要單倍體型不同于其他3個(gè)流行區(qū)。

3 討論

多項(xiàng)研究已證實(shí)pfama1和pvama1基因的DⅠ區(qū)域(94～247 aa)多態(tài)性高于DⅡ(265～363 aa)和DⅢ區(qū)域(388～451 aa)[16,17]。本研究中，云南省中緬邊境地區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域的分析結(jié)果顯示，中緬邊境區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域的多態(tài)性(π=0.015)低于泰國(π=0.021)和巴布新幾內(nèi)亞(PNG，π=0.018)流行區(qū)，但高于韓國流行區(qū)(π=0.013)。有研究報(bào)道，間日瘧原蟲抗原多態(tài)性程度與流行區(qū)瘧原蟲傳播密度高度相關(guān)[18]。泰國和PNG為間日瘧原蟲高度流行區(qū)，而中緬邊境和韓國流行區(qū)為間日瘧原蟲低密度流行區(qū)。因此，中緬邊境和韓國流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域多態(tài)性低于泰國和PNG地區(qū)。Tajima′sD*檢驗(yàn)獲取的陽性結(jié)果提示各流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域在進(jìn)化過程中經(jīng)歷陽性選擇，為宿主免疫系統(tǒng)作用的靶位，此結(jié)果與其他流行區(qū)pvama1基因DⅠ區(qū)域的中性檢驗(yàn)結(jié)果一致[16,17]。

有效的pvama1疫苗除應(yīng)具有強(qiáng)免疫原性可誘導(dǎo)宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答外，應(yīng)能涵蓋流行區(qū)主要單倍體型，以應(yīng)對(duì)由于pvama1基因的抗原多樣性而導(dǎo)致的疫苗失效[19]。Structure分析顯示，世界范圍內(nèi)4個(gè)不同地域的v單倍體型可分為3個(gè)亞群，各主要單倍體型普遍存在于各流行區(qū)，提示制備廣泛有效pvama1疫苗的可能性。但本研究選取樣本量有限，使用小樣本量進(jìn)行的群體遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)分析容易產(chǎn)生偏差，如：基于非洲惡性瘧流行區(qū)大樣本量(n=506)測(cè)序發(fā)現(xiàn)pfama1可分為16個(gè)不同亞群，而相同流行區(qū)小樣本量(n=61)分析則顯示pfama1可分為6個(gè)亞群[20,21]。因此，pvama1基因多種單倍體型在不同地域流行區(qū)的分布特點(diǎn)有待深入研究。本研究中，Structure分析顯示，中緬邊境地區(qū)、泰國和PNG的單倍體型亞群模式相似，提示在上述流行區(qū)具有相同或相似的pvama1單倍體型?；诖朔N各流行區(qū)普遍存在的單倍體型制備的疫苗可能在上述流行區(qū)均有良好的保護(hù)性免疫效果。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)全球4個(gè)不同流行區(qū)pvama1基因的DⅠ結(jié)構(gòu)域具有較高多態(tài)性，為宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原靶位。種群結(jié)構(gòu)分析顯示，各主要流行區(qū)pvama1基因可分為3個(gè)亞群。除韓國流行區(qū)外，其他流行區(qū)亞群結(jié)構(gòu)相似，提示相同或相似的pvama1單倍體型存在于上述流行區(qū)。大樣本量不同流行區(qū)pvama1基因的測(cè)序可揭示多種單倍體型，并完善流行區(qū)pvama1基因的種群結(jié)構(gòu)分析，為研制覆蓋不同流行區(qū)pvama1基因單倍體型的疫苗提供理論基礎(chǔ)。