中藥玄參對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖及BCL-2和C-myc表達(dá)的影響

★ 伍慶華 李龍雪 宋渺渺 閔建新（江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一［1］，絕大部分都起源于濾泡的上皮細(xì)胞。甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制目前不明確，與其相關(guān)的因素包括很多方面，但都有BCL-2與 C-myc的過度表達(dá)有關(guān)［2］。不同類型的甲狀腺癌，其生物學(xué)的特性和臨床表現(xiàn)、診斷及其治療和預(yù)后均有所差異［3-4］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為甲狀腺癌的發(fā)生多與情志不暢、肝郁氣滯或痰濕凝聚有關(guān)。司富春等［5］將近幾十年的成方經(jīng)歸類后發(fā)現(xiàn)治療甲狀腺腫瘤多以清熱化痰、滋陰涼血［6-7］及疏肝解郁為治法，且特別重視疏肝解郁和滋陰養(yǎng)血藥物的選用。滋陰中藥玄參在臨床上應(yīng)用已經(jīng)有很久的歷史，清熱涼血、能清營血分之熱；養(yǎng)陰生津，能清熱邪而滋陰液。現(xiàn)代中醫(yī)臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥玄參對(duì)食管癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、淋巴瘤等腫瘤具有較好的臨床療效。

本研究以甲狀腺癌SW579細(xì)胞為研究對(duì)象，從細(xì)胞凋亡的角度探討玄參抗甲狀腺癌的機(jī)制，為玄參治療甲狀腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 甲狀腺癌細(xì)胞株（SW579細(xì)胞，2015年購于上海細(xì)胞庫）；玄參（江西藥都樟樹中藥飲片有限公司，批號(hào)：2015106000）；二甲基亞砜（DMSO，德國Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO12800-82）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國Amresco公司）；牛血清（FBS，美國ExCell Biology FSS500）；溴化乙錠（EB，BioBasic INC（BBI）；Transzol試劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；TranScript first-strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要儀器 2-16K高速低溫離心機(jī)（德國Sigma公司）；-80℃冰箱（美國Thermo Forma公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）；CX41型倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS）；SZK型醫(yī)用超凈工作臺(tái)（蘇州空氣凈化技術(shù)有限公司）；精密電子天平（Mettler Toledo Group）；MK3型酶標(biāo)儀（奧地利Anthos公司）。

2 方法

2.1 玄參提取液的制備 向玄參水煮液中加入95%乙醇至藥液含醇量為50%，密封4℃冷藏48h后濾過，并用95%乙醇洗滌沉淀，收集濾液，濾液經(jīng)真空減壓回收得深棕色浸膏。

2.2 MTT法檢測(cè)各藥物組細(xì)胞抑制率 將SW579細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃無CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液，密度為8×104個(gè) /μL接種于 96孔板中，100μL/孔。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，加入不同濃度中藥玄參提取液（玄參濃度 100μg/μL，1/2 倍梯度減至 0.09765625μg/μL）；48h后用PBS小心漂洗2次，每孔加入完全培養(yǎng)基100μL及MTT10μL；繼續(xù)培4h后吸棄上清，每孔加入DMSO 100μL，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上震蕩10min使結(jié)晶完全溶解，在波長490nm下測(cè)定吸光度A值。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)IC值取玄參濃度3.125μg/μL、0.390625μg/μL、0.09765625μg/μL 三個(gè)組別作為高中低濃度組，陰性對(duì)照組：培養(yǎng)液中只有細(xì)胞無藥物。

2.4 Real-Time PCR檢測(cè)BCL-2和C-myc表達(dá)水平 將不同濃度玄參提取液孵育的SW579細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行RT-PCR分析。PCR引物均由南京金斯瑞科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物純化方式：PAGE；引物序列及PCR產(chǎn)物大?。簈hGAPDH primer（115bp）、Sense primer：5-CATCTTCTTTTGC GTCGCCA-3、Antisense primer：5-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3，qhBCL2 primer（81bp）、Sense primer：5-ATCCAGGATAACGGAGGC-3、Antisense primer：5-CAGCCAGGAGAAATCAAAC -3、qhC-myc primer（119bp），Sense primer：5-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3、Antisense primer：5-CTGCGT AGTTGTGCTGATGT-3實(shí)驗(yàn)過程按試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5μL于2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并用Image J軟件分析圖像。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析及顯著性，兩兩比較采用LSD法。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05，

有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同藥物濃度抑制率的比較 通過MTT實(shí)驗(yàn)，不同藥物濃度的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組數(shù)據(jù)相比，通過t檢驗(yàn)，P值均＜0.05。由此可得，玄參提取液隨著濃度的升高，對(duì)甲狀腺SW579細(xì)胞生長的抑制率也越高，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且玄參提取液對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。見表1。

表1 48h玄參提取液對(duì)SW579細(xì)胞增值的影響（）

表1 48h玄參提取液對(duì)SW579細(xì)胞增值的影響（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01 ；與上一組高濃度比較，#P＜0.01

組別 均值/標(biāo)準(zhǔn)差 抑制率/%對(duì)照組 0.746±0.017 -空白組 0.0451 -玄參 100μg/μL 0.087±0.008* 88.34玄參 50μg/μL 0.158±0.011*# 78.82玄參 25μg/μL 0.205±0.014*# 72.55玄參 12.5μg/μL 0.262±0.012*# 64.85玄參 6.25μg/μL 0.324±0.021*# 56.54玄參 3.125μg/μL 0.387±0.011*# 48.18玄參 1.5625μg/μL 0.412±0.02*# 44.83玄參 0.78125μg/μL 0.525±0.005*# 29.62玄參 0.390625μg/μL 0.604±0.02*# 19.06玄參 0.1953125μg/μL 0.651±0.01*# 12.76玄參 0.09765625μg/μL 0.672±0.02*# 9.89

3.2 各組BCL-2mRNA的表達(dá)與C-myc mRNA表達(dá)比較 低濃度組、中濃度組和高濃度組BCL-2 mRNA與C-myc mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P＜0.01），中濃度組和高濃度組BCL-2 mRNA與C-myc mRNA表達(dá)水平均低于低濃度組（P＜0.01），高濃度組BCL-2 mRNA與C-myc mRNA表達(dá)水平低于中濃度組（P＜0.01）。見表2。

表2 玄參提取液對(duì)SW579細(xì)胞增殖的影響（）

表2 玄參提取液對(duì)SW579細(xì)胞增殖的影響（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01 ；與低濃度比較，#P＜0.01；與中濃度比較，△P＜0.01。

組別 BCL-2 C-myc對(duì)照組 0.278586287±0.0110452 1.000309831±0.0304504玄參 0.09765625μg/μL 0.211683754±0.010071* 0.749320631±0.0329353*玄參 0.390625μg/μL 0.154137237±0.0066958*# 0.518559426±0.0152854*#玄參 3.125μg/μL 0.080030921±0.003226*#△ 0.214025643±0.0142201*#△

4 討論

多年以來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)中藥玄參的化學(xué)成分進(jìn)行過廣泛的研究，在已有的研究結(jié)果中表明顯示，玄參中最主要的是苯乙醇苷和含環(huán)烯醚萜兩類化學(xué)成分［8］，此外，還有三萜皂苷、黃酮類、有機(jī)酸、脂肪酸和揮發(fā)油等其他類型的化合物［9］。中醫(yī)成方經(jīng)歸類后發(fā)現(xiàn)治療甲狀腺腫瘤多以清熱化痰、滋陰養(yǎng)血、疏肝解郁為治法，玄參作為清熱涼血、養(yǎng)陰生津的藥物使用頻次特別高。

甲狀腺癌為常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。在多種致癌因素的作用下，原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及參與細(xì)胞增殖與分化調(diào)控的細(xì)胞周期調(diào)控因子的變化等都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前對(duì)甲狀腺癌相關(guān)基因的研究領(lǐng)域，主要集中在酪氨酸激酶受體基因的重排（RET／PTC）、C-myc、BCL-2、c-fos、Rb 基因等方面［10］。

BCL-2可抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的功能，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示玄參作用于SW579細(xì)胞后能下調(diào)細(xì)胞中BCL-2的表達(dá)，導(dǎo)致SW579細(xì)胞的增殖受抑制。C-myc是常見的原癌基因，參與細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的生理過程［11］，抑制C-myc基因表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，玄參能下調(diào)SW579細(xì)胞中C-myc的表達(dá)，導(dǎo)致甲狀腺癌細(xì)胞增殖的抑制。MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還顯示，玄參提取液對(duì)SW579細(xì)胞增殖的抑制效果呈濃度依賴性。但是本實(shí)驗(yàn)只有玄參提取液對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行了初步探討，并非符合人體藥代動(dòng)力學(xué)的特征。因此要更準(zhǔn)確了解玄參抗腫瘤的機(jī)制還需要完善動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步了解藥物在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞作用的機(jī)理。