miRNA的研究進度與問題總結

王繹尊

摘 要：MicroRNA（miRNA）是一類內生的、長度約20～24個核苷酸的小RNA，目前動植物的miRNA研究已經開展多年，幾個miRNAs也可以調節(jié)同一個基因，機體可以通過幾個miRNAs的組合來精細調控某個基因的表達，進而產生某些特定的性狀。據推測，miRNA調節(jié)著人類三分之一的基因。本文針對目前國內外對于miRNA的研究手段及研究過程中所遇到的問題進行論述，展望未來miRNA的發(fā)展。

關鍵詞：miRNA；northen blot；熒光定量PCR；miRNA芯片

研究目的：一小部分miRNA被發(fā)現有著調節(jié)細胞生長，組織分化的作用，因而與生命過程中發(fā)育，疾病有關。例如，miR-273和ly56，編碼的miRNA的研究在醫(yī)學上是一個極受關注的領域。

一、研究背景

DNA、RNA和蛋白質是生命科學研究的三大主體，DNA、RNA和蛋白質之間的關系是經典和現代化法則的核心內容；通常情況下，RNA是DNA和蛋白質之間的“過渡”。近年來的研究表明，RNA在生命進程中扮演的角色遠比我們早年設想的更為重要。

二、主要研究手段

northen blot（諾瑟雜交）：Northen blot（諾瑟雜交）是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達的方法，通過northern blot的方法可以檢測到細胞在生長發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達情況。Northen blot首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段。

熒光定量PCR（Polymerase Chain Reaction聚合酶鏈式反應）：熒光定量PCR（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是1996 年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度，而熒光定量PCR對檢測miRNA主要有兩種比較常見的手段：①TaqMan熒光探針法：該方法在特異性探針的兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，熒光基團發(fā)光被淬滅基團吸收；在PCR擴增過程中，探針被降解，熒光基團與淬滅基團分離，發(fā)出可被檢測到的熒光，以此來監(jiān)測整個PCR過程；②SYBR熒光染料法：該方法利用了SYBRGreen熒光染料非特異性與雙鏈DNA結合并發(fā)光的特性檢測PCR的全部進程，從而判定初始RNA的量。

三、研究手段對比

Norhten blot相對熒光定量PCR會比較精確，但是相對操作難度較大，由于需要采用瓊脂糖凝膠電泳，隨后將其原位轉移至固相支持物上，再用放射性（或非放射性）標記的12DNA或RNA探針，依據其同源性進行雜交，最后進行放射自顯影，實驗步驟繁雜，而且由于存在轉移和雜交過程，可能會對實驗結果存在影響。

四、研究方向

多種miRNA的功能和miRNA的可調控性。

五、目前的研究進度

目前大多數miRNA的功能仍然是個謎，人們發(fā)現了小部分但較富有價值的miRNA的功能，如1L-21 miRNA（限制一種最常見形式的艾滋病毒的復制），Mirc19（在衰老過程中調控造血干細胞的維持和生存），并且一些miRNA具有多種功能，有些miRNA甚至具有功能選擇性，發(fā)表在大學的研究團隊對人類和小鼠基因組中的初級miRNA的轉錄本進行了全面注釋。DROSHA酶在miRNA的加工中負責剪切pri-miRNA。研究人員用一個顯性負突變的DROSHA穩(wěn)定了人類和小鼠細胞中的pti-miRNA。隨后他們對細胞核RNA進行了深度測序，并通過計算工具StringTie來組裝轉錄本。研究通過這種方式，注釋了69%的人類miRNA和75%的白鼠miRNA。過去人們普遍認為，簇集在一起的miRNA是共轉錄的。但研究人員發(fā)現，一些miRNA簇其實具有選擇性啟動子，這令研究人員十分吃驚。研究進度幾乎可以認為直接取決于目前的技術水平，而由上文的研究手段可以看出，目前對miRNA的研究只停留在探測階段，甚至對miRNA的探測技術也并不完善，northen blot與熒光定量PCR這兩種技術對miRNA的探測仍然有很大的缺陷和誤差，已被發(fā)現的miRNA的功能種類相對于整個miRNA體系可謂是滄海一栗，而且每個miRNA的功能都很強大，不可能直接將miRNA應用到醫(yī)學中，因此miRNA的研究仍然有很大空間。

六、目前已發(fā)現的部分miRNA及其作用

調控疾病的發(fā)生與發(fā)展。疾病、相關miRNAs 、流感 miR-21，miR-223 、丙型肝炎miR-122，miR-155 、艾滋病 miR-28，miR-125b，miR-223，miR-382、二型miR-144，miR-150，miR-182，miR-103，miR-107、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 miR-146a。

七、未來觀望

目前一部分miRNA的功能的認知缺乏是由于現代的技術限制，northern blot為檢測miRNA的主要手段，缺點為敏感度低（許多mblot為檢測miRNA的主要手段，缺點為敏感度低（許多miRNA都可能檢測不到），耗時長，RNA的用量較大。另一種方法為熒光定量PCR，相對northern blot的半定量技術，熒光定量PCR為精確定量，但耗材較貴，也只能探究mblot的半定量技術，熒光定量PCR為精確定量，但耗材較貴，也只能探究miRNA的量。而最可能與最首要的便是改變對miRNA的研究技術，目前除了northen blot和熒光定量PCR這兩種主要技術外，還存在一種技術叫做Agilent miRNA芯片（Agilent miRNA芯片是miRNA芯片中的一種，也存在其他miRNA芯片，因為Agilent miRNA芯片缺點更少，故以該技術為例），相對與northen blot與熒光定量PCR而言，Agilent miRNA芯片具有以下優(yōu)點：①特殊的探針設計，保證只識別成熟miRNA；②高靈敏度，可識別一個堿基差異，檢測下限<0.1amol；③寬的動態(tài)檢測范圍：檢測豐度跨5～6個logs，有利于檢測到更寬豐度范圍的miRNA；④高重復探針，每個miRNA重復約20次，數據更精準；⑤樣品需求量低，只需要100mg總miRNA；⑥不需要分離miRNA，避免丟失及引起誤差。

八、結論

miRNA芯片技術是針對miRNA研發(fā)的，相對northen blot與熒光定量PCR對miRNA的檢測也更加專業(yè)與深入，未來的miRNA研究技術極大可能是以這種mirRNA芯片技術為基礎來研發(fā)的，但目前由于miRNA芯片技術大多被商業(yè)化，以及基金問題，miRNA芯片技術沒有及時得到推廣，但未來這種技術可能會隨著基金的增長與該技術的不斷改進被普及，相信不久后，miRNA的研究又會更上一個臺階。

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