中藥黑芝麻不同炮制品體外抗氧化作用研究*

劉 君，張麗艷，幕楊娜，張彬彬

1遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3中國(guó)人民解放軍第201醫(yī)院

中藥黑芝麻始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其藥味甘，性平，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，益精血，潤(rùn)腸燥之效?？捎糜谥委熅澨摗㈩^暈眼花、耳鳴耳聾、須發(fā)早白、病后脫發(fā)、腸燥便秘［1］。現(xiàn)代研究［2］表明，黑芝麻及其有效成分芝麻素等有多種藥理作用，具有抗氧化、抗衰老、降壓作用及促黑素生成等作用。而其藥理作用多與其抗氧化作用相關(guān)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黑芝麻生用及炮制后應(yīng)用功效有差異。古代醫(yī)家認(rèn)為其生用可化痰，涼血解毒。如治療小兒瘰疬、浸淫惡瘡、小兒頭瘡等。現(xiàn)代常用炒黑芝麻，炒后香氣濃，具有補(bǔ)益肝腎、填精補(bǔ)血、潤(rùn)腸通便的功效。主要用于治療頭昏、頭痛、眼花、耳鳴、須發(fā)早白或脫發(fā)、腸燥便秘等［3］。以唐代孫思邈流傳下來(lái)的以“九蒸九曬”的方法炮制黑芝麻，做成丸，每日服用，久服可明目洞視，腸柔如筋［4］。晉朝葛洪在《抱樸子》中云：“芝麻三斗，蒸熟后曬干，用水淘去沫再蒸再曬，如此反復(fù)九次”［5］。古人炮制黑芝麻的工序如此的繁瑣，對(duì)其功能究竟有何影響，有必要進(jìn)行深入的研究。本研究對(duì)黑芝麻生品、炒制品、九蒸九曬炮制品的提取物進(jìn)行了體外抗氧化作用研究，并對(duì)三者的體外抗氧化作用進(jìn)行了比較，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料

1.1 藥材 黑芝麻生品，購(gòu)于遼寧省藥材公司(市售)，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)王延年副教授鑒定為黑芝麻(Sesamum indicum L.)。Vc購(gòu)于上海化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與試劑 U-3010型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司)。所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 黑芝麻不同炮制品的制備

2.1.1 炒黑芝麻 取黑芝麻生品，按照《中國(guó)藥典》一部(2015版)清炒法，炒至有爆聲，即得。

2.1.2 九蒸九曬黑芝麻 取黑芝麻生品，置蒸鍋內(nèi)，蒸制30分鐘，取出，涼曬至干。反復(fù)重復(fù)9次，即得。

2.2 黑芝麻生品及炮制品提取物的制備 取黑芝麻生品、炒黑芝麻、九蒸九曬黑芝麻粉碎，過(guò)40目篩，分別以6倍量95%的乙醇超聲提取2次，每次20分鐘，3 000 r/min離心，取上清液，合并上清，得乙醇提取物。取殘?jiān)稍?，揮盡乙醇，再分別以6倍量的水超聲提取2次，每次20分鐘，3000r/min離心，取上清液，合并上清，得水提取物。合并水提取物及乙醇提取物［6］。減壓回收溶劑，真空干燥后，分別得到生黑芝麻提取物(SHE)、炒黑芝麻提取物(CHE)、九蒸九曬黑芝麻提取物(ZHE)。

2.3 黑芝麻提取物體外抗氧化作用研究 Vc作陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水稀釋成0.3 mg/mL的溶液，于4℃貯存，備用。

2.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 二苯基苦味肼自由基(DPPH·)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波長(zhǎng)517 nm處有強(qiáng)烈吸收。在有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)，從而使其褪色，褪色程度與其接受電子呈定量關(guān)系，因而可用比色法進(jìn)行定量分析［7］。將樣品SHE、CHE、ZHE用甲醇分別配制成相當(dāng)于含生 藥 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 溶液。DPPH用無(wú)水乙醇配制成2×10-4mol/L的溶液。準(zhǔn)確吸取樣品待測(cè)溶液、DPPH溶液各2 mL，混勻后室溫下放置30分鐘，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度得Ai，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)水乙醇代替DPPH測(cè)定吸光度值作為對(duì)照Aj空白，以DPPH溶液和無(wú)水乙醇混合測(cè)吸光度Ac。按式(1)計(jì)算各待測(cè)樣品對(duì)DPPH 自由基的清除率［8］。

式中：Ai為2 mL樣品溶液+2 mLDPPH試劑混合液的吸光度；Aj為2 mL樣品溶液+2 mL空白溶劑(無(wú)水乙醇)混合液的吸光度；Ac為2 mLDPPH溶液+2 mL空白溶劑混合液的吸光度［9］。

2.3.2 超氧自由基O2-·清除能力的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法。分別配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 的樣品溶液，精密吸取l mL，分別加入4.5 mL，50 mmol/L的pH=8.2的Tris-HCl緩沖液，然后混勻，于25℃恒溫水浴中保溫20分鐘后取出，立即加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液O.3 mL，快速搖勻后于25℃恒溫水浴中反應(yīng)5分鐘，再加入8 mmol/L HCl l mL，混勻后終止反應(yīng)，在325 nm測(cè)定吸光度，以蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。以Vc作陽(yáng)性對(duì)照［10］。

每個(gè)樣品均平行測(cè)定3次，取平均值。按式(2)計(jì)算清除率。

式中：A0為空白的平均吸光度；A1為樣品溶液的平均吸光度。

2.3.3 清除羥自由基能力的測(cè)定 Fenton是產(chǎn)生·OH最常用的反應(yīng)，原理如下：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH。其原理是利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系中加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。H2O2的量和Fe反應(yīng)產(chǎn)生的·OH量成正比。將樣品SHE、CHE、ZHE 配制成相當(dāng)于含生藥 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的樣品溶液，樣品組試管中分別加入 1 mL0.15 mmol/L FeSO40.4 mL 2 mmol/L水楊酸、0.2mL樣品溶液、1mL6mmol/LH2O2和0.4mL蒸餾水；空白組用蒸餾水代替樣品溶液，對(duì)照組用蒸餾水代替水楊酸，37℃反應(yīng)30分鐘。以Vc作陽(yáng)性對(duì)照［11］。

每個(gè)樣品均平行測(cè)定3次，取平均值。清除率計(jì)算公式(3)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析及計(jì)算IC50值。

3 結(jié)果

黑芝麻生品及炮制品和Vc在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，清除率隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度時(shí)，清除率趨于平衡。黑芝麻生品、炒制品、蒸曬品及VC的 IC50分別為 0.405、0.194、0.088、0.009 mg/mL。經(jīng)方差分析，黑芝麻生品組與炒制組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；黑芝麻生品組與蒸曬組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。炒制與九蒸九曬方法炮制后，黑芝麻DPPH清除能力增強(qiáng)。炒制組與蒸曬組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05)。但從數(shù)據(jù)觀測(cè)，3個(gè)樣品中，蒸曬品清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，九蒸九曬方法炮制的黑芝麻比炒制的方法DPPH清除能力更強(qiáng)。

黑芝麻生品及炮制品和Vc在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基的清除能力呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，清除率隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，黑芝麻生品、炒制品、蒸曬品及Vc的IC50分別為1.058、0.632、0.225、0.07 mg/mL。表明 3個(gè)樣品中，蒸曬品的清除能力最強(qiáng)，炒制品其次，生品最弱。方差分析表明，黑芝麻生品組與炒制組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；黑芝麻生品組與蒸曬組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；炒制組與蒸曬組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)果表明九蒸九曬的炮制方法能顯著的增強(qiáng)黑芝麻羥基自由基的清除能力，而炒法炮制黑芝麻對(duì)其羥基自由基的清除能力的影響不太顯著。圖1—3、見(jiàn)表1。

圖1 DPPH·的清除率比較

圖2 超氧自由基清除能力比較

圖3 羥基自由基的清除能力比較

表1 黑芝麻生品及不同炮制品的清除率

4 討論

現(xiàn)代研究表明，黑芝麻具有多種藥理作用，如對(duì)心臟及腎臟的保護(hù)作用、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤作用、抗炎、降壓作用及促黑素生成，生發(fā)與烏發(fā)等作用［12］。而其多種藥理作用都與其抗氧化作用有關(guān)。黑芝麻含有多種化學(xué)成分，主要包括：木脂素類(lèi)，如芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚、芝麻林素酚、芝麻酚、松脂醇等；脂類(lèi)，如油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、二十四烷酸、卵磷脂、甾醇等；維生素類(lèi)，如維生素 E、煙酸、維生素 B1、B2、葉酸等；還有微量元素，如含鈣、鐵、鋅、硒、銅、錳等；其他成分如黑芝麻色素、胡麻苷、蛋白質(zhì)類(lèi)、糖類(lèi)等［13］。

黑芝麻的炮制方法現(xiàn)代多采用炒法。研究表明，芝麻炒后，化學(xué)成分的種類(lèi)及含量與生品有一定的差異。高溫焙炒后，芝麻素的含量明顯下降，芝麻林素的含量也急劇降低，芝麻林素是芝麻油諸多抗氧化物中一種非常重要前體物質(zhì)，在焙炒下可轉(zhuǎn)化為芝麻素酚和芝麻酚，二者作為天然的有機(jī)酚類(lèi)化合物，具有很強(qiáng)的抑菌和抗氧化活性。芝麻酚在生品當(dāng)中不存在，炒后高溫下經(jīng)芝麻林素質(zhì)子化水解轉(zhuǎn)化而來(lái)，再經(jīng)過(guò)形成水和陽(yáng)離子及分子內(nèi)構(gòu)轉(zhuǎn)化為芝麻素酚。炒后水溶性的木脂素芝麻素酚三糖苷受熱不穩(wěn)定，易發(fā)生分解，生成芝麻素酚［14］。焙炒芝麻油中的反式脂肪酸含量隨溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多，隨著焙炒時(shí)間的延長(zhǎng)，絲氨酸、胱氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸的含量明顯減少，而可溶性糖的含量隨焙炒時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸降低的趨勢(shì)［15］。這些化學(xué)成分的改變必然會(huì)對(duì)其藥理作用產(chǎn)生影響。