消銀湯對小鼠鼠尾表皮細(xì)胞分化及Th1/Th2型細(xì)胞因子的影響*

薛曉東，宋紅霞

1重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院皮膚科，重慶 萬州 404000；2重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥理教研室

銀屑病是一種由多基因遺傳、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的免疫異常性的慢性、增生性、炎癥性皮膚病［1-4］。消銀湯是筆者的臨床經(jīng)驗方，治療尋常型銀屑病療效滿意。本研究以鼠尾鱗片表皮模型為銀屑病的動物模型，觀察消銀湯對銀屑病小鼠模型的治療作用，并以Th1/Th2細(xì)胞因子為切入點探討其可能的作用機制，從而為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠50只，SPF級，體質(zhì)量為18～22 g，雌雄兼用，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物實驗合格證號：SYXK(渝)2012-0001；在溫度 16～26℃，相對濕度40%～70%實驗環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 藥物與儀器 消銀湯藥物組成：黃芩10 g，生地黃15 g，牡丹皮12 g，赤芍15 g，半枝蓮30 g，白花蛇舌草15 g，槐花10 g，紫草10 g，玄參15 g，丹參15 g，雞血藤15 g，甘草6 g。制備方法：稱取各藥材，用水煎煮制備，共煎煮2次，煎出液合并，濃縮到每劑藥168 mL。消銀湯的人體推薦攝入量為168 g/d生藥，相當(dāng)于2.8 g/(kg·d)生藥(成人以60 kg計)。甲氨蝶呤片(上海信誼藥業(yè)有限公司，批號：20130403)，小鼠 IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號：201310)，光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，LP-400酶標(biāo)儀(法國巴斯德公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 取昆明種小鼠50只，雌雄各半，將小鼠隨機分為5組，每組10只，即空白對照組(等體積生理鹽水)，消銀湯高劑量組(69.0g/kg)、中劑量組(34.5 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量)、低劑量組(17.3 g/kg)，甲氨蝶呤組(2 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量，用生理鹽水配制成所需濃度)，各組灌胃給藥，每天2次，連續(xù)14天，給藥容積為35 mL/kg。

1.3.2 小鼠尾部鱗片顆粒層鱗片數(shù) 末次給藥24小時后進(jìn)行眼球取血，室溫靜置15分鐘，3 000 r/min離心15分鐘后分離血清，置于-70℃保存，用于IFN-γ、IL-4的濃度測定。處死小鼠后，取鼠尾距根部約1.8 cm處的背面皮膚一長條(1.5 cm×0.2 cm)，進(jìn)行 10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，HE染色，光鏡下觀察每個小鼠的尾部鱗片并計數(shù)每100個鱗片中有顆粒層的鱗片數(shù)(凡鱗片表皮有連續(xù)成行的顆粒細(xì)胞層者，稱為有顆粒層形成的鱗片)。對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，并作統(tǒng)計學(xué)處理。

1.3.3 小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4含量 從冰箱取出各組血清樣本，恢復(fù)至室溫，操作步驟按照IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成數(shù) 小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成數(shù)消銀湯高、中劑量組，甲氨蝶呤組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；消銀湯高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；消銀湯低劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 小鼠血清IFN-γ、IL-4含量 IFN-γ、IL-4消銀湯高、中、低劑量組和空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。消銀湯高、中、低劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表1 各組小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成數(shù)比較(±s)

表1 各組小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成數(shù)比較(±s)

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.01；b表示與甲氨蝶呤組比較，P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/(g·kg-1) 有顆粒層的鱗片數(shù)/100個鱗片空白對照組 10 - 6.61±2.86消銀湯高劑量組 10 69.0 19.45±4.17ab消銀湯中劑量組 10 34.5 13.56±3.04a消銀湯低劑量組 10 17.3 7.37±3.13甲氨蝶呤組 10 2.0 14.79±3.93a

表2 各組小鼠血清IFN-γ、IL-4含量比較(±s)

表2 各組小鼠血清IFN-γ、IL-4含量比較(±s)

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.01；b表示與空白對照組比較，P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量 /(g·kg-1)IFN-γ/(ng·mL-1)IL-4/(ng·mL-1)空白對照組 10 - 7.09±2.10 3.66±1.67消銀湯高劑量組 10 69.0 3.29±1.08b 6.64±2.28b消銀湯中劑量組 10 34.5 4.16±1.39b 6.00±2.12b消銀湯低劑量組 10 17.3 4.86±1.50b 5.45±1.43a甲氨蝶呤組 10 2.0 3.83±1.29 5.66±1.73a

3 討論

銀屑病模型包括銀屑病小鼠模型、佛波酯誘導(dǎo)動物模型、異種移植動物模型、自發(fā)性或基因突變模型、異種移植動物模型等，但均不能完全反映銀屑病的組織病理學(xué)特點，其應(yīng)用均具有局限性［5］。銀屑病表皮的主要病理生理學(xué)特點包括增生過快和角化不全2個方面［6］。小鼠尾部鱗片的表皮因天然顆粒層細(xì)胞缺失，故可模擬銀屑病角化不全的特點。通過比較小鼠尾部有顆粒層的鱗片數(shù)，可以較好地評價藥物促進(jìn)顆粒層形成的作用［3］，該模型被作為篩選抗銀屑病藥物的常用模型［5］。

銀屑病發(fā)病機制尚不清楚，目前實驗研究表明T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫紊亂是銀屑病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)［7］，其中活化的Th細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵性作用［8］。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，主要功能為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，輔助細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化，參與遲發(fā)性超敏反應(yīng)等；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，主要功能為介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，輔助B細(xì)胞增殖與分化，參與Ⅰ型超敏反應(yīng)等［9］。近年來Th1/Th2比例失衡學(xué)說受到異常關(guān)注，認(rèn)為銀屑病患者Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子明顯增多，而Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子相對減少是引起銀屑病發(fā)病的重要原因，且表現(xiàn)為典型的Th1優(yōu)勢應(yīng)答［10］。由于Th1細(xì)胞以分泌IFN-γ為特征，Th2細(xì)胞以分泌IL-4為特征，故IFN-γ/IL-4可作為Thl/Th2細(xì)胞失衡的主要指標(biāo)［3］。

本研究結(jié)果表明，消銀湯高、中劑量組均可顯著增加小鼠尾部鱗片顆粒層形成數(shù)，其中高劑量組與甲氨蝶呤組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；各劑量組均可顯著降低IFN-γ的水平，并可升高IL-4的水平，與甲氨蝶呤組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示消銀湯可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子動態(tài)平衡，促進(jìn)小鼠尾部表皮顆粒層細(xì)胞形成而發(fā)揮治療作用。