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    清肝祛濕活血方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠腫瘤壞死因子α及肝臟組織的影響*

    2018-10-23 05:29:22張玉香王一強(qiáng)姜德民王鳳麗史曉偉陳有源王俊喹甘肅省中醫(yī)學(xué)校甘肅蘭州70050甘肅省中醫(yī)院蘭州市安寧區(qū)醫(yī)院西和縣中醫(yī)院
    西部中醫(yī)藥 2018年8期
    關(guān)鍵詞:清肝列酮羅格

    張玉香 ,王一強(qiáng) ,姜德民 ,王鳳麗 ,史曉偉 ,陳有源 ,王俊喹 甘肅省中醫(yī)學(xué)校,甘肅 蘭州 70050;甘肅省中醫(yī)院;蘭州市安寧區(qū)醫(yī)院;西和縣中醫(yī)院

    非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFLD)是肝細(xì)胞性肝硬化的重要病因[1-2]。近年來,發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[3-4]。而中醫(yī)藥在治療NAFLD方面起到越來越重要的作用,主要作用機(jī)制為調(diào)節(jié)脂肪組織分泌和儲(chǔ)存、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等[5],具有多靶點(diǎn)治療、安全可靠的特點(diǎn)。清肝利濕活血方為王俊喹經(jīng)驗(yàn)方,用于治療肝經(jīng)濕熱瘀阻型NAFLD。前期臨床研究[6]表明,其具有改善NAFLD患者臨床癥狀,降低體質(zhì)指數(shù)、腰圍,改善肝功能和胰島素抵抗,調(diào)節(jié)血脂代謝的作用。本研究采用高脂飲食建立NAFLD大鼠模型,觀察清肝祛濕活血方對(duì)NAFLD大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)及肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響,現(xiàn)報(bào)道如下:

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取同批清潔級(jí)SD大鼠,雄性,90只,體質(zhì)量130~170 g,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(甘)2011-0001。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 清肝祛濕活血方藥物組成:茵陳10g,郁金 10g,青葙子 10g,丹參 15g,夏枯草 10g,密蒙花10 g,垂盆草10 g。由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備中藥煎劑。羅格列酮片(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字H20041399,規(guī)格4 mg/粒)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物研究所。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 GS300型血糖儀(華廣生技股份有限公司);OHAUS1/1000型電子天平(美國BECKANCOULTER公司);IX71-22FL/PH型倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司);LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司);TC-120型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(孝感泰維電子設(shè)備有限公司);HH-S型數(shù)顯水浴箱(金壇醫(yī)療儀器廠);5417R型低溫離心機(jī)(德國艾本德公司);TC-120型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北泰維電子設(shè)備有限公司)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 動(dòng)物分組與造模 將90只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組,模型對(duì)照組,羅格列酮組,清肝祛濕活血方高、中、低劑量組,每組15只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天,常規(guī)飲食,自由飲水。從第8天開始正常組給予普通飼料,連續(xù)60天;其余各組按照聶文山等[7]的造模方法,予高脂飼料(84%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+1%膽固醇)喂養(yǎng)1周后腹腔注射四環(huán)素(150 μg/g,然后每隔6天腹腔注射1次四環(huán)素)100 μg/g;分別于實(shí)驗(yàn)開始前及造模后第 6、12、18、24、30 天稱量大鼠的體質(zhì)量,依據(jù)造模大鼠體質(zhì)量的變化改變給藥量,造模時(shí)間30天。

    1.4.2 給藥方法 參考《藥物試驗(yàn)方法學(xué)》[8],按照人與大鼠的體質(zhì)量換算,大鼠的等效劑量為:生藥11.25 g/kg。中藥復(fù)方高、中、低劑量組依次為生藥22.50、11.25、5.63 g/kg。將清肝祛濕活血方用蒸餾水配制成濃度為0.28、0.56、1.13 g/mL的溶液。根據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道,羅格列酮組用藥劑量為3mg/(kg·d)造模成功后大鼠平均體質(zhì)量按200g/只計(jì)算,干預(yù)組各大鼠每日灌胃給藥1次,每次4 mL。正常對(duì)照組與模型對(duì)照組分別給予蒸餾水灌胃,1/d次,4 mL/次。各組大鼠連續(xù)灌胃30天,末次灌胃24小時(shí)后處死并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

    1.4.3 觀察指標(biāo)

    1.4.3.1 TNF-α測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前大鼠空腹至少8小時(shí),經(jīng)鼠尾采血5 mL,室溫放置2小時(shí)后,離心15分鐘,3 000 r/min,取上清液,放冰箱-20℃保存。TNF-α采用酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測(cè)。

    1.4.3.2 肝臟組織病理形態(tài)觀察 處死大鼠,迅速摘取肝組織,并將肝臟浸泡于10%甲醛內(nèi)固定,石蠟包埋,切片,進(jìn)行常規(guī)HE染色。肝組織脂變程度判斷標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

    表1 肝組織脂變程度判斷標(biāo)準(zhǔn)

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料用(±s)表示,采用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 血清TNF-α 羅格列酮致大鼠死亡1只,中藥復(fù)方低、中、高劑量組分別死亡2只,2只及4只。血清TNF-α水平,與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,清肝祛濕活血方各劑量組及羅格列酮組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠血清TNF-α水平比較(±s)

    表2 各組大鼠血清TNF-α水平比較(±s)

    注:*表示與空白對(duì)照組比較,P<0.05;#表示與模型對(duì)照組比較,P<0.05

    組別 只數(shù) 劑量/(g·kg-1) TNF-α/(mol·L-1)空白對(duì)照組 15 - 0.88±0.14模型對(duì)照組 15 - 2.68±0.20*羅格列酮組 14 0.55 1.69±0.11#低劑量組 13 5.63 2.08±0.16#中劑量組 13 11.25 1.72±0.18#高劑量組 11 22.5 1.35±0.14#

    2.2 肝臟組織病理形態(tài) 空白對(duì)照組大鼠肝臟外形大小正常,呈紅色,肝小葉內(nèi)未見脂滴肝細(xì)胞,為陰性。模型對(duì)照組大鼠腹腔肥大,肝體積增大明顯,脂肪組織豐富,表面粗糙呈灰黃色,肝血竇擴(kuò)張,充血,切面油膩感,胞質(zhì)內(nèi)幾乎均呈脂滴肝細(xì)胞,為(++++)。與模型對(duì)照相比較,羅格列酮組,中藥復(fù)方低、中劑量組大鼠肝臟脂肪組織含量減少,肝臟體積偏大,呈暗紅色。脂變程度較輕,空泡樣變肝細(xì)胞數(shù)目明顯減少,胞漿內(nèi)僅見少量脂肪滴,為(++)。中藥復(fù)方高劑量組肝臟脂變程度明顯減輕,肝小葉基本完整,空泡樣變肝細(xì)胞消失,為(+)。見圖1。

    圖1 肝組織病理切片(HE×400)

    3 討論

    NAFLD的發(fā)病與胰島素抵抗和遺傳易感性關(guān)系密切。根據(jù)臨床不同時(shí)期的臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)中“脂滿”“肝著”“積聚”“痰證”等范疇。本課題組認(rèn)為NAFLD的病機(jī)為肝火旺盛、濕熱瘀結(jié)。清肝祛濕活血方以夏枯草清肝散郁;密蒙花清熱瀉火,養(yǎng)肝明目;青葙子清肝涼血;茵陳清熱利濕、退黃;垂盆草清熱解毒、利膽;丹參、郁金散結(jié)化瘀,行氣通絡(luò)。諸藥合用活血化瘀,清肝祛濕[10-11]。

    近來有關(guān)炎癥因子TNF-α在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關(guān)注[12]。TNF-α是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,其可通過增加氧自由基和脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致脂肪性肝纖維化。黃永紅[13]研究指出,NAFLD發(fā)展到一定階段時(shí),脂肪組織中的TNF-α水平與胰島素抵抗呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),TNF-α是非糖基化細(xì)胞因子,是炎癥和代謝失衡的重要脂肪因子,可引起線粒體功能不全、肝細(xì)胞變性壞死及炎細(xì)胞浸潤,加重脂肪肝的程度[14-15]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí),清肝祛濕活血方高劑量干預(yù)組可顯著降低NAFLD大鼠TNF-α水平,說明清肝祛濕活血方可通過增強(qiáng)機(jī)體對(duì)TNF-α的清除能力來改善NAFLD。這與相關(guān)文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。

    綜上所述,清肝祛濕活血方防治非酒精性脂肪肝可能的機(jī)制是下調(diào)肝臟TNF-α水平。

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