壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠NF-κB/IκB信號通路的影響

蔣耀平,肖敬,趙先鋒,謝議鳳,蒙繼勇,劉江,張國峰

(柳州市中醫(yī)醫(yī)院,廣西 柳州 545001)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis RA)是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，有時(shí)被歸類為具有共同臨床表現(xiàn)的綜合征[1]。它是最常見的免疫相關(guān)性慢性炎癥自身免疫性疾病[2-3]。關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞在RA的病理生理過程中扮演著關(guān)鍵性的角色，滑膜細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子參與RA的整個(gè)病理過程，其中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1)與關(guān)節(jié)滑膜炎癥、軟骨和骨降解的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直[4]。而NF-κB的過度活化能夠引起前炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β等)的合成與釋放。大量的前炎性細(xì)胞因子又反過來進(jìn)一步活化NF-κB/IκB信號通路，導(dǎo)致更多致炎因子的生成，這種正反饋放大作用形成“瀑布效應(yīng)”，使得炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇[5]。因此，NF-κB/IκB信號通路在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。

目前，對RA的治療常用藥物主要包括非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素和生物制劑等，但均存在不同程度的不良反應(yīng)[6]。壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸療法是采用經(jīng)過多種壯藥制備液浸泡過的直徑約為0.7 mm的苧麻線，將一端在燈火上點(diǎn)燃，使之形成圓珠狀炭火，將此炭火迅速而敏捷地直接灼灸在人體穴位上，用以治療疾病的一種外治方法[7]。自上世紀(jì)八十年代開始，隨著壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸療法的挖掘研究不斷深入，其在多種疾病中的應(yīng)用得到肯定。在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面亦有多項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道療效確切，但對于其作用機(jī)制的研究甚少。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤治療佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠效果顯著，并發(fā)現(xiàn)可能與調(diào)控關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡有關(guān)。在本項(xiàng)研究中，我們通過建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型，以壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤為干預(yù)條件，探討NF-κB/IκB信號通路在其中所扮演的角色，為壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供更加全面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑有：兔抗鼠多克隆抗體P65、I-kBα、TNF-α、IL-1β、COX-2和β-actin購于Proteintech(美國)，兔抗山羊IgG/辣根酶標(biāo)記購自北京中杉金橋生物科技有限公司。TNF-α、IL-1 酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，qPCR Mix購自成都福際生物科技有限公司。干預(yù)的藥物甲氨蝶呤片(上海信誼藥廠有限公司)，壯醫(yī)藥線規(guī)格有2號、3號藥線。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選擇清潔級6～8周齡健康成年SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)表分為空白對照組(NC)、關(guān)節(jié)炎模型組(RA)、甲氨蝶呤治療組(MTX)、甲氨蝶呤聯(lián)合壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸治療組(CT)，每組10只且性別比例相同。除空白對照組外，其余3組于嚴(yán)格無菌條件下，向每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(CFA)0.1 mL致炎，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎發(fā)生。待繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)，標(biāo)志佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型造模成功。

1.3 干預(yù)方法

1.3.1 甲氨蝶呤

RA造模2周后，MTX組灌胃給藥甲氨蝶呤(1 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)給藥36 d；CT組連續(xù)36 d灌胃給藥甲氨蝶呤(1 mg·kg-1·d-1)，同時(shí)壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸干預(yù)。

1.3.2 壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸

操作手法：采用2號或3號藥線，將呈珠狀炭火的線頭對準(zhǔn)應(yīng)灸部位或經(jīng)穴快速點(diǎn)灸，如雀啄食，一觸即起，此為一壯，一般一穴灸1～3壯。10 d為一療程，休息3天開始第2療程，觀察治療3療程。取穴方法：整體取穴：根據(jù)壯醫(yī)整體治療原則，每次取腎俞、脾俞、下關(guān)元、足三里(雙)、食背(雙)、趾背(雙)、勞宮、涌泉。局部取穴：根據(jù)壯醫(yī)“寒手熱背腫在梅，各疾施灸不離鄉(xiāng)”的原則，受累關(guān)節(jié)取梅花穴。

1.4 關(guān)節(jié)炎指數(shù)測定

關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[6]：腳爪正常，無紅腫癥狀，為0分；趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕度紅腫，為1分；趾關(guān)節(jié)和足趾出現(xiàn)紅腫，為2分；整個(gè)腳爪出現(xiàn)紅腫，為3分；踝關(guān)節(jié)紅腫，嚴(yán)重變形，不能負(fù)重，為4分。每隔3 d對每個(gè)大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分，并計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

1.5 取材

干預(yù)結(jié)束后各實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。處死大鼠，迅速取炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織100 mg，平均分為2份，分別用于qPCR檢測和Western blotting檢測。

1.6 ELISA檢測

各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量測定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒提供的說明書進(jìn)行。

1.7 組織RNA提取和qPCR檢測

液氮研磨法將組織研磨充分，TRIzol法提取RNA，檢測RNA濃度后按照試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。內(nèi)參選擇β-actin。目的基因和內(nèi)參引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，詳見表1。cDNA與qPCR Mix嚴(yán)格按照生產(chǎn)商提供的說明書混合后使用qPCR儀(杭州安杰思醫(yī)學(xué)科技有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物完整性評估使用溶解曲線，mRNA水平評估使用擴(kuò)增循環(huán)值(CT)，2-ΔΔCT用于計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平。

表1 qPCR引物序列

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)

液氮研磨組織，加入組織裂解液勻漿提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，上樣緩沖液處理后，10%SDS-PAGE電泳，每孔上樣30 μg，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶ 500稀釋)4℃孵育過夜，充分洗膜后室溫孵育二抗，再次充分洗膜后ECL孵育，并曝光。使用Image J圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算樣本蛋白相對表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±S.E.M)表示，使用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較

各組大鼠每3天評估一次關(guān)節(jié)炎指數(shù)，結(jié)果如圖1所示,與正常對照組相比，RA組關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨時(shí)間顯著增加(P<0.05)；與RA組相比，MTX組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨時(shí)間顯著降低(P<0.05)；CT組與MTX組相比，大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)亦顯著降低(P<0.05)。

注：*P<0.05 VS NC; #P<0.05 VS RA;▲P<0.05 VS MTX圖1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分

2.2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量測定

采用ELISA方法檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量，結(jié)果如圖2所示：與NC組相比，RA組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量顯著增高(P<0.05)；甲氨蝶呤和壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)后，大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量顯著降低(P<0.05 VS RA)，其中壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)降低更顯著(P<0.05 VS MTX)。提示甲氨蝶呤和壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)能夠顯著抑制佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子釋放。

2.3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中P65、I-kBα、TNF-α、IL-1β和COX-2基因表達(dá)情況

使用qPCR方法檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中P65、I-kBα、TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA的表達(dá)情況。各基因溶解曲線如圖3所示，可見引物特異性良好。由圖4和5可知，與NC相比，RA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中P65、TNF-α、IL-1β和COX-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高(P<0.05)，I-kBα mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)；甲氨蝶呤和壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)后P65、TNF-α、IL-1β和COX-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低(P<0.05 VS RA)，其中CT組降低更為顯著(P<0.05 VS MTX)，I-kBα mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高(P<0.05 VS RA)，其中CT組升高更為明顯(P<0.05 VS MTX)。提示壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)具有顯著協(xié)同作用。

2.4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中P65、I-kBα、TNF-α、IL-1β和COX-2蛋白表達(dá)情況

Western blotting法檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中P65、I-kBα、TNF-α、IL-1β和COX-2的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖6所示：與NC相比，RA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中P65、TNF-α、IL-1β和COX-2 mRNA蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，I-kBα顯著下調(diào)(P<0.05)；甲氨蝶呤和壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)后P65、TNF-α、IL-1β和COX-2 mRNA蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05 VS RA)，其中CT組下調(diào)更為顯著(P<0.05 VS MTX)，I-kBα蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05 VS RA)，其中CT組上調(diào)更為明顯(P<0.05 VS MTX)。提示壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)具有顯著協(xié)同作用。

注:*P<0.05 VS NC；▲P<0.05 VS RA；#P<0.05 VS MTX圖2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量變化

圖3 各基因溶解曲線

圖4 各實(shí)驗(yàn)組各基因擴(kuò)增曲線

注:*P<0.05 VS NC；▲P<0.05 VS RA；#P<0.05 VS MTX圖5 各實(shí)驗(yàn)組P65、I-kBα、TNF-α、IL-1β和COX-2 mRNA相對表達(dá)水平

注：*P<0.05 VS NC；▲P<0.05 VS RA；#P<0.05 VS MTX圖6 各實(shí)驗(yàn)組P65、I-kBα、TNF-α、IL-1β和COX-2蛋白表達(dá)水平

3 討論

根據(jù)《全球疾病負(fù)擔(dān)》2010年的研究報(bào)告，因RA喪失勞動(dòng)能力的人口從1990年的2 566 000人增加到了2010年的3 776 000人[8]。隨著全世界人口老齡化和死亡率下降，未來幾十年內(nèi)，RA患者的數(shù)量將大幅度增加。臨床迫切需要更加有效的治療方法。

目前對于RA的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，遺傳、環(huán)境、感染等被認(rèn)為是密切相關(guān)的致病因素。臨床常采用藥物干預(yù)控制RA癥狀，但很難根除。甲氨蝶呤是最近幾年來得到國際公認(rèn)的、有效治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性藥，是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎首選藥物[9]。作為一種葉酸還原酶抑制劑，除了能夠抑制細(xì)胞DNA合成，發(fā)揮抗腫瘤作用外，其還能夠發(fā)揮免疫和抗炎的作用[10]。甲氨蝶呤的不良反應(yīng)主要有惡心、嘔吐、腹瀉、口腔糜爛、厭食等胃腸道癥狀，以及脫發(fā)、肺炎、轉(zhuǎn)氨酶升高、肝纖維化及血液學(xué)異常等，但大部分不良反應(yīng)都較短暫而且較輕[11]。研究報(bào)道顯示，相比于單用甲氨蝶呤治療，甲氨蝶呤與其他藥物聯(lián)合治療RA療效更優(yōu)，不良反應(yīng)無明顯增加甚至減少[12-13]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤治療佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠效果優(yōu)于兩者單獨(dú)使用，且與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有很大的內(nèi)在聯(lián)系，但對于其具體的作用機(jī)制仍不是很清楚。

關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要特征之一。浸潤細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[14]。這些細(xì)胞分泌促炎因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，造成炎癥入侵，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨等破壞[15]。關(guān)節(jié)滑膜周圍的巨噬細(xì)胞由血液中的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變，其過程受趨化因子的影響。一旦巨噬細(xì)胞被激活，分泌大量的炎性介質(zhì)(包括IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-10,IL-15,IL-17,TNF-α和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、促炎因子、生長因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶[16]。所有這些因素均可引起炎癥，并在滑膜和關(guān)節(jié)損傷中起主要作用[17]。在本項(xiàng)研究中，我們建立佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型，ELISA法檢測關(guān)節(jié)炎大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量，發(fā)現(xiàn)相比于正常大鼠，關(guān)節(jié)炎大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量顯著增大，提示TNF-α和IL-1β與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。而壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤進(jìn)行干預(yù)治療后，關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量顯著降低，提示壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤能夠抑制炎癥因子的釋放。在前期的研究中，觀察的30例壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床患者，發(fā)現(xiàn)壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸能夠顯著降低患者血清中TNF-α和IL-1β的水平[18]，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，NF-κB是調(diào)控炎癥的主控器，包括 NF-κB1 (p50/p105), NF-κB2 (p52/p100), RelA (p65),c-Rel和RelB，調(diào)節(jié)著免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡[19-20]。NF-κB在多種自身免疫性疾病中被活化，包括RA[21]。在RA中，活化的NF-κB信號通路增強(qiáng)TNF-a、IL-Iβ、環(huán)氧化酶2(COX2)等基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)增強(qiáng)的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)又能夠促使NF-κB信號通路進(jìn)一步活化[22]。本研究中關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB p65表達(dá)顯著增加，IκB-α顯著下調(diào)，與他人研究結(jié)果一致[23-24]。予以壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)后，NF-κB p65及下游TNF-α、IL-Iβ和COX2表達(dá)顯著下降，IκB-α明顯增加。提示壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB的活化，進(jìn)而抑制TNF-α、IL-Iβ等炎性因子的釋放和環(huán)氧化酶2(COX2)的表達(dá)，從而達(dá)到改善RA癥狀，達(dá)到治療目的的。

綜上，本項(xiàng)研究通過建立佐劑大鼠關(guān)節(jié)炎模型，并予以壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)，結(jié)果顯示其能夠顯著改善大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，且其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控NF-κB/IκB信號通路，從而抑制炎癥因子釋放和環(huán)氧化酶的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合甲氨蝶呤治療RA效果明確，優(yōu)于各自單獨(dú)使用，且本項(xiàng)研究建立了較為完善的理論依據(jù)，進(jìn)一步的研究重點(diǎn)將集中在臨床治療實(shí)踐方面，為臨床普及進(jìn)一步完善相關(guān)數(shù)據(jù)。