HPLC法測定雙黃水凝膠中鹽酸小檗堿的含量

岑志芳，吳曉純，鄭昊圳，陳麗純，劉桂燕，羅文安，陳創(chuàng)偉

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，廣東佛山528000）

雙黃水凝膠是按照一定的處方量，以黃連和黃柏為主藥，實驗室自主研發(fā)配制而成的細(xì)膩均勻，易于涂布，滲透性良好的新型中藥復(fù)方經(jīng)皮給藥制劑。其中黃連的有效成分主要為生物堿類季胺堿,如小檗堿等，屬于廣譜抗菌藥物,具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗菌消炎、利膽等藥理作用［1］；黃柏味苦，性寒，常用于治療清熱燥濕、瀉火解毒，消腫祛腐等癥狀［2］，小檗堿是其主要成分。黃連得黃柏相助，功專于下，加強(qiáng)清熱燥濕、解毒瀉火、抗菌消炎等作用，可用于治療濕疹、濕瘡、皮炎等疾病。鹽酸小檗堿是雙黃凝膠的主要的藥效成分，因此，采用科學(xué)簡便的含量測定方法，能夠有效的進(jìn)行定量分析，保證臨床藥效，也為后續(xù)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。本文旨在用高效液相色譜法測定鹽酸小檗堿的含量，為該藥質(zhì)量控制提供可行性手段。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀；JJ300型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；UV-1600PC型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；AS5150B超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

雙黃凝膠（實驗室自制，批號：170507；170508；170509）；鹽酸小檗堿對照品（含量:86.8%，批號：110713-200911，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈(色譜級，批號：JA028430，默克股份科技兩合公司）；甲醇（色譜級，批號：I754507441，默克股份科技兩合公司）；水（去離子水，實驗室自制）；無水乙醇（分析純，批號：160830，廣東光華科技股份有限公司）；十二烷基硫酸鈉（批號：980706，汕頭光華化學(xué)廠）；磷酸二氫鉀（批號：20170118，廣東光華科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備

精密稱量10 mg鹽酸小檗堿對照品置100 mL容量瓶中，用甲醇溶液（含1%的鹽酸）溶液溶解定容，搖勻，制得濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

精密稱取制備好的雙黃凝膠劑1 g用甲醇溶液（含1%的鹽酸）溶解，少量多次轉(zhuǎn)移并定容至10 mL，搖勻，再精密量取2 mL用流動相稀釋定容至10 mL，搖勻即得。

2.1.3 陰性對照品制備

按處方比例配制不含藥液的凝膠同2.1.2項的方法配制陰性對照品溶液。

2.2 測定波長選擇

以陰性對照品作空白對照，將供試品溶液在紫外分光光度計上，于200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選取最大吸收波長345 nm作為檢測波長。

2.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 ml中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）為流動相；流速為1.5 mL·min-1；檢測波長為345 nm;柱溫為室溫。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于5 000［3］。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

分別精密吸取對照溶液、陰性對照品溶液與供試品溶液各20 μL，在2.3項的色譜條件下測定。結(jié)果色譜行為良好，鹽酸小檗堿峰與其他組分色譜峰可達(dá)到基線分離，且與相鄰色譜峰分離度為5.00，理論板數(shù)28 486。供試品與對照品在同一保留時間的波峰出現(xiàn)，而陰性對照則無相應(yīng)的干擾峰，說明本方法具有良好的專屬性，見圖1。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 定量限

精密量取已知濃度的對照品溶液1 mL，進(jìn)行一系列的稀釋過程，直至信噪比S/N=10，此時濃度為2.55 μg/mL。

圖1 雙黃凝膠HPLC色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系的考察

已知對照品溶液濃度為105.6 μg/mL，分別精密吸取混合對照品溶液0.5，1，2，3，4，5 mL于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以鹽酸小檗堿濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿的回歸方程為A=70.640×C+12.841（r＝0.999 8，n＝6），線性范圍為 4.58～45.83 μg·mL-1。

2.5.3 精密度試驗

精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液，每天進(jìn)樣1次，連續(xù)6 d測定峰面積，計算RSD%為0.59%。

表1 精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.5.4 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批凝膠樣品（批號：170507），照2.1.2項下方法平行制備2個不同濃度的樣品，每個濃度配制三份供試品溶液，分別測定。鹽酸小檗堿的平均含量分別為11.79 mg/g，RSD%為1.18%，表明方法的重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果（n=6）

2.5.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液，分別于配置后0、1、2、4、8、12、24 h測定峰面積，鹽酸小檗堿的RSD%為1.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=6）

2.5.6 加樣回收試驗

精密稱取等量的同一批號樣品（批號：170507）配制成供試品溶液（共9份），分別加入相當(dāng)于樣品含量50%、100%、150%不同質(zhì)量濃度的對照品溶液適量，搖勻，再按上述色譜條件進(jìn)樣分析，回收率為99.74%，RSD=1.49%。

表4 加樣回收率結(jié)果（n=9）

2.6 樣品測定

精密稱取3批樣品各0.1 g，按上述供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，依上述色譜條件測定峰面積，并計算出樣品中鹽酸小檗堿的平均含量為11.92 mg/g。

表5 樣品中鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果

3 討論

中藥制劑中測定鹽酸小檗堿含量的方法主要有：分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法［4-5］，每種方法有各自的優(yōu)缺點，本次實驗采用高效液相色譜法來測定雙黃凝膠中的主要藥效成分鹽酸小檗堿的含量，此法操作簡便，精密穩(wěn)定，靈敏度高，專屬性好等優(yōu)點。雖然已有文獻(xiàn)報道采用HPLC法測定鹽酸小檗堿的含量，但是分析的中藥制劑成分不同，影響因素不同，測定波長和流動相也有所差別，因此方法在制定后要進(jìn)行方法學(xué)考察，保證測定方法的準(zhǔn)確性。

流動相的配置后必須經(jīng)過超聲脫氣處理才可以使用，否則容易產(chǎn)生氣泡堵住色譜柱，使分析結(jié)果不準(zhǔn)確。鹽酸小檗堿是季銨堿類生物堿，堿性極強(qiáng)，極性較大，在C18反相HPLC系統(tǒng)容易拖尾，因此在流動相中加入反離子試劑以形成離子對，能有效抑制拖尾，改善峰形，故本次實驗中加入了十二烷基磺酸鈉的離子緩沖鹽［6-7］，可以有效防止拖尾，峰形分離效果良好，但是十二烷基磺酸鈉是表面活性劑，易產(chǎn)生泡沫，噪音大，所以每次測定結(jié)束后都要較長時間洗柱，也有相關(guān)文獻(xiàn)［8］采用加入了三乙醇胺也能有效防止拖尾，改善峰形。

藥液在提取過程中使用的60%的乙醇溶液，小檗堿是呈游離態(tài)存在，故在配制供試品溶液時要滴加適量的鹽酸溶液于甲醇中，使得小檗堿與鹽酸反應(yīng)生成鹽酸小檗堿，使測得的結(jié)果更加準(zhǔn)確。