枇杷葉黃酮類化合物含量測(cè)定及抗氧化性研究

黃 瓊

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，福建福州350119）

枇杷葉系薔薇科枇杷屬植物枇杷的干燥葉，又名巴葉，是傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)常用的中草藥［1］。枇杷葉具有清肺止咳、降逆止嘔的作用，臨床用于治療肺熱咳嗽、胃熱嘔吐、氣逆喘氣及煩熱口渴之癥狀［2］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)枇杷葉的化學(xué)成分進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)其含有黃酮類、揮發(fā)油、倍半萜類、三萜類等活性成分［3］。

黃酮類化合物廣泛存在于天然產(chǎn)物中，具有多種生理學(xué)活性和藥理作用，其具有抑菌、防癌抗癌、抗心率失常、抗氧化、抗衰老、抗心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、降血脂、護(hù)肝、解肝毒、治療急、慢性肝炎及肝硬化等功能［4-10］。枇杷葉黃酮類化合物的測(cè)定常用的方法有分光光度法和高效液相色譜法［11］。在實(shí)際科研工作中，考慮到方法的簡(jiǎn)便、快捷及可行性，多采用分光光度法測(cè)定黃酮類化合物含量。本文采用分光光度法測(cè)定枇杷葉黃酮類化合物含量，并考察枇杷葉黃酮類化合物對(duì)·OH和O2-·的清除作用，為枇杷葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 原料

枇杷葉：于5月中旬采集于福清26度休閑農(nóng)莊，經(jīng)摘取、清洗，晾干，放入干燥箱干燥后，粉碎、密封保存，備用。

1.1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，（UV≥99%）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

FS-1200N超聲波處理器：上海生析超聲儀器有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ST-80索氏提取裝置：北京賽福萊博科技有限公司；FZ102微型植物粉碎機(jī)：北京格拉威爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.020 0 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，以60%乙醇溶解，定容，精確量取25 mL置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，即得0.1 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用紫外可見(jiàn)光度計(jì)對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和枇杷葉提取液進(jìn)行190～600 nm范圍內(nèi)的掃描。在蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液中均發(fā)現(xiàn)在310 nm處出現(xiàn)明顯而無(wú)干擾的獨(dú)立峰。因此，將310 nm作為最大吸收波長(zhǎng)。取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于25 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，于310 nm處測(cè)其吸光度。以吸光度A與濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

1.2.2 枇杷葉黃酮類化合物含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取干燥枇杷葉10.0 g，置于500 mL燒杯中，加入100 mL的70%乙醇，置于超聲清洗儀中進(jìn)行超聲波處理，然后用轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心機(jī)進(jìn)行離心，離心15 min，離心后棄去殘?jiān)∩锨逡?，?zhǔn)確移取上清液5.0 mL，置于250 mL容量瓶中，以60%乙醇溶解，定容至刻度。準(zhǔn)確移取2.0 mL樣品液，通過(guò)蘆丁回歸方程計(jì)算枇杷葉黃酮類化合物含量，其計(jì)算公式為：

1.2.3 加標(biāo)回收率的測(cè)定

分別準(zhǔn)確移取 0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.348 g·L-1），與 0.1 mL樣品溶液（10.430 g·L-1）混合，分別用無(wú)水乙醇定容至25 mL，于310 nm處測(cè)吸光度，其計(jì)算公式為［12］：

1.2.4 枇杷葉黃酮類化合物對(duì)·OH的清除作用

準(zhǔn)確移取 1.0 mL0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg·mL-1樣品液于 25 mL 具塞比色管中，依次加入 2 mmol·L-1的 FeSO4的 3.0 mL、6 mmol·L-1的水楊酸 3.0 mL，搖勻，再分別向各比色管中加入2 mmoL·L-1的H2O23.0 mL，搖勻，于37℃恒溫水浴反應(yīng)15 min，取出在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)1，以0.0 mg·mL-1樣品液吸光值為A0，計(jì)算樣品液對(duì)·OH的清除率，其計(jì)算公式如下［13］：

式中：A0為空白管的吸光值；A1為樣品液的吸光值。

1.2.5 枇杷葉黃酮類化合物對(duì)O2-·的清除作用

準(zhǔn)確移取 1.0 mL 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg·mL-1樣品液 1.0 mL，再加入 5.0 mL 50 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液（pH=8.2），25℃水浴20 min后，取出迅速加入0.1 mL25 mmol·L-1的鄰苯三酚，混勻保溫10 min后，立刻加入2滴10 mol·L-1的HCl終止反應(yīng)，溶液在波長(zhǎng)325 nm處的吸光值X1，同法測(cè)定用蒸餾水代替鄰苯三酚后的吸光值X2，及以1.0 mL蒸餾水替代樣品溶液后的吸光值X0，來(lái)計(jì)算樣品液對(duì)O2-·的清除率，其計(jì)算公式如下［14-15］

式中，X1為樣品溶液吸光值；X2為蒸餾水替代鄰苯三酚后的吸光值；X0為蒸餾水替代樣品溶液后的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷葉黃酮類化合物含量測(cè)定

按1.2.1和1.2.2方法進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和黃酮類化合物含量的測(cè)定，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量與吸光度之間滿足關(guān)系式A=9.751 4 C+5×10-5，R2=0.999 9，式中：C為蘆丁質(zhì)量濃度g·L-1，A為吸光度，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品含量在0.00～0.05 g·L-1范圍與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)回歸方程計(jì)算出枇杷葉黃酮類化合物含量為78.86 mg·g-1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 樣品回收率

按1.2.3方法進(jìn)行樣品回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，平均加標(biāo)回收率為100.2%，RSD為0.94%。符合規(guī)定，表明紫外分光光度法可用于測(cè)定枇杷葉總黃酮含量，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度較高。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

2.3 枇杷葉黃酮類化合物對(duì)對(duì)·OH的清除作用

按1.2.4的方法進(jìn)行清除對(duì)·OH的測(cè)定，以對(duì)·OH的清除率為因變量，以樣品濃度為自變量，作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，枇杷葉黃酮類化合物對(duì)·OH有清除作用，在枇杷葉黃酮類化合物質(zhì)量濃度為0.2～1.4 mg·mL-1范圍內(nèi)，其清除·OH能力隨著黃酮類化合物質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.4 mg·mL-1時(shí)，對(duì)·OH清除率最高為82.9%。

圖2 枇杷葉黃酮類化合的對(duì)·OH-清除作用

2.4 枇杷葉黃酮類化合物對(duì)O2-·的清除作用

按1.2.5的方法進(jìn)行清除O2-·的測(cè)定，以對(duì)O2-·的清除率為因變量，以樣品濃度為自變量，作圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，枇杷葉黃酮類化合物對(duì)O2-·有清除作用，在黃酮類化合物質(zhì)量濃度為0.2～1.4 mg·mL-1范圍內(nèi)，黃酮類化合物清除O2-·能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)其濃度為1.4 mg·mL-1時(shí)，對(duì)O2-·-清除率最高為77.3%。

圖3 枇杷葉黃酮類化合的對(duì)O2-·清除作用

3 結(jié)論

本文采用分光光度法測(cè)定枇杷葉中黃酮類化合物含量，其含量為78.86 mg·g-1，樣品回收率為100.2%，說(shuō)明紫外分光光度法測(cè)定枇杷葉中總黃酮含量的分析方法是一種可行性強(qiáng)，適合一般實(shí)驗(yàn)室操作的方法。

枇杷葉黃酮類化合物能夠有效清除·OH和O2-·，枇杷葉黃酮類化合物質(zhì)量濃度為1.4 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)·OH和O2-·的清除率分別為82.9%和77.3%，說(shuō)明枇杷葉黃酮類化合物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且清除作用隨枇杷葉黃酮類化合物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。