魚油納米乳液運載體系構(gòu)建與穩(wěn)定性研究

江連洲 綦玉曼 馬春芳 劉寶華 王中江 李 楊,3

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院， 哈爾濱 150030; 2.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司， 德州 251200; 3.哈爾濱食品產(chǎn)業(yè)研究院， 哈爾濱 150028)

0 引言

魚油是一種富含亞油酸、油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等多種不飽和脂肪酸的功能性油脂，具有調(diào)血脂、降低血壓、健腦益智等作用，在功能性食品行業(yè)具有廣闊的應用前景。然而，魚油易氧化、水溶性差、生物利用率低限制了其應用。

已有研究表明：納米乳液可以作為一種輸送魚油到液體食品系統(tǒng)中的有效形式，保護魚油不被氧化、掩蓋異味并提高生物利用度[1-5]。在納米乳液中常用小分子表面活性劑(如吐溫[6]、司盤[7]等)作為乳化劑，但這種化學合成表面活性劑的使用及其吸收模式，存在一定安全性隱患，因此，研究人員開始探索使用天然生物大分子作為乳化劑，其中大豆分離蛋白(Soybean protein isolated，SPI)因其高營養(yǎng)價值廣受消費者青睞，然而天然大豆蛋白的乳化性無法滿足納米乳液制備要求，因此必須對大豆蛋白進行適當?shù)母男訹8]。近年來有研究表明，蛋白質(zhì)與磷脂復合可改善其乳化特性。李秋慧等[9]向大豆蛋白溶液中加入磷脂，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白的乳化性顯著提高。XUE等[10]用酪蛋白酸鈉和卵磷脂混合制備的透明百里香油納米乳液有小于100 nm的流體動力學直徑，并且比單獨酪蛋白酸鈉或卵磷脂制備的納米乳液具有更小平均粒徑和更窄的粒徑分布。本文應用大豆蛋白與磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)復合作為乳化劑，通過高壓均質(zhì)技術構(gòu)建魚油納米乳液，以吐溫20作為乳化劑包埋的魚油納米乳液為參照，評估大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液在不同溫度、pH值、鹽離子濃度下的穩(wěn)定性，為構(gòu)建安全、綠色、低成本、高穩(wěn)定性的新型納米食品技術提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白、魚油，山東禹王有限公司；磷脂酰膽堿，索萊寶公司；吐溫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

ULTRA-TURRAX UTL2000型乳化機，德國IKA儀器設備公司；試驗型高壓均質(zhì)機，英國Stansted Fluid Power公司；Nano-ZS90型粒度分析儀，英國馬爾文公司；紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；DeltaVision OMX SR型超高分辨顯微鏡，美國通用電氣公司；PHSJ-4A型實驗室pH計，中國上海雷磁公司；電子分析天平(精度0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液制備

將大豆蛋白和磷脂酰膽堿溶于緩沖液(pH值7.0、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液)中，室溫(20℃)下連續(xù)攪拌12 h，作為水相；把魚油按比例加到水相中，用高速分散器以20 000 r/min均質(zhì)5 min，形成粗乳液。將粗乳液通過高壓均質(zhì)機進一步均質(zhì)乳化即得大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液。

參照樣品吐溫20魚油納米乳液的制備：將2 g吐溫20溶于98 g蒸餾水中，室溫下連續(xù)攪拌1 h，作為水相；把魚油按比例加到水相中，用高速分散器以20 000 r/min均質(zhì)5 min，形成粗乳液。將粗乳液通過高壓均質(zhì)機進一步均質(zhì)乳化即得吐溫20魚油納米乳液。

1.3.2單因素試驗

以SPI質(zhì)量分數(shù)、磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)、魚油質(zhì)量分數(shù)、均質(zhì)壓力為考察因素進行單因素試驗，通過測定魚油納米乳液平均粒徑、多分散性指數(shù)(Polydispersity index，PDI)、ζ-電位、濁度確定制備大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液的最優(yōu)參數(shù)。

(1)SPI質(zhì)量分數(shù)

分別將質(zhì)量分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%的SPI和0.2%的磷脂酰膽堿溶于緩沖液(0.05 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖溶液)中，室溫下連續(xù)攪拌12 h，緩慢加入1.5%的魚油，制備粗乳液。設置高壓均質(zhì)機均質(zhì)壓力為100 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次，測定制備的魚油納米乳液平均粒徑、PDI、ζ-電位和濁度。

(2)磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)

分別將質(zhì)量分數(shù)為2%的SPI和0、0.2%、0.4%、0.6%、1%的磷脂酰膽堿溶于緩沖液(0.05 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖溶液)中，室溫下連續(xù)攪拌12 h，緩慢加入1.5%的魚油，制備粗乳液。設置高壓均質(zhì)機均質(zhì)壓力為100 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次，測定制備的魚油納米乳液平均粒徑、PDI、ζ-電位和濁度。

(3)魚油質(zhì)量分數(shù)

將質(zhì)量分數(shù)為2%的SPI和0.2%的磷脂酰膽堿溶于緩沖液(0.05 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖溶液)中，室溫下連續(xù)攪拌12 h，緩慢加入0.5%、1%、1.5%、2%、3%的魚油，制備粗乳液。設置高壓均質(zhì)機均質(zhì)壓力為100 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次，測定制備的魚油納米乳液平均粒徑、PDI、ζ-電位、濁度。

(4)均質(zhì)壓力

將質(zhì)量分數(shù)為2%的SPI和0.2%的磷脂酰膽堿溶于緩沖液(0.05 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖溶液)中，室溫下連續(xù)攪拌12 h，緩慢加入1.5%的魚油，制備粗乳液。設置均質(zhì)壓力分別為60、80、100、120、140 MPa，均質(zhì)3次，測定制備的魚油納米乳液平均粒徑、PDI、ζ-電位和濁度。

1.3.3魚油納米乳液平均粒徑、PDI及ζ-電位測定

用Zetasizer Nano-ZS 90型光散射粒度分析儀分別測定上述魚油納米乳液平均粒徑、粒徑分布及ζ-電位變化，魚油油滴的折射率設置為1.45，水相溶液折射率設置為1.33。為降低多重光散射效應，分析前用pH值7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋魚油乳液1 000倍測平均粒徑及PDI，稀釋100倍測ζ-電位。

1.3.4魚油納米乳液濁度測定

將魚油納米乳液用磷酸鹽緩沖液溶液稀釋40倍，以磷酸鹽緩沖液為空白對照，用紫外分光光度計測定600 nm處的吸光度，濁度計算公式為

T=1.302AV/I

式中A——稀釋乳液在600 nm處的吸光度

V——稀釋倍數(shù)

I——光程差，取1 cm

1.3.5微觀觀測

魚油納米乳液超高分辨顯微鏡的檢測參照PUPPO等[11]的方法。大豆蛋白經(jīng)尼羅藍染液染色后呈現(xiàn)紅色熒光，魚油經(jīng)脂溶性熒光探針尼羅紅染色后呈現(xiàn)綠色熒光。分別將0.001 g/mL尼羅紅和0.01 g/mL尼羅藍溶解在異丙醇中，漩渦混合30 s后對魚油納米乳液染色30 min。染色結(jié)束后取5 μL乳液于載玻片上，采用超高分辨顯微鏡觀測魚油納米乳液的顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.6乳液穩(wěn)定性

(1)儲藏穩(wěn)定性

將最優(yōu)條件制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液和吐溫20魚油納米乳液分別于4、25、50℃密封儲藏30 d，每隔5 d取樣，測乳液的平均粒徑、ζ-電位。

(2)鹽離子濃度穩(wěn)定性

參照陳冬等[12]的方法配置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液和0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L的CaCl2溶液。用不同濃度的NaCl溶液和CaCl2溶液將最優(yōu)條件制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液和吐溫20魚油納米乳液稀釋為原體積的2倍，靜置2 h后，測定乳液平均粒徑和ζ-電位。

(3)pH值穩(wěn)定性

參照陳冬等[12]的方法用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)最優(yōu)條件制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液和吐溫20魚油納米乳液pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，靜置2 h后，測定乳液的平均粒徑和ζ-電位。

1.3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)均平行測定3次取平均值，用SPSS Statistics 22對數(shù)據(jù)進行ANOVA差異顯著性分析，p<0.05為顯著性差異，用Origin 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

在高壓均質(zhì)、超聲、微射流等高能法制備納米乳液的過程中，納米乳液的性質(zhì)主要受乳化劑濃度、油相濃度以及投入的機械能強度和持續(xù)時間的影響[13]。因此，本研究主要討論SPI質(zhì)量分數(shù)、磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)、魚油質(zhì)量分數(shù)及均質(zhì)壓力對魚油納米乳液性質(zhì)的影響。

2.1 SPI質(zhì)量分數(shù)

納米乳液是指含有平均粒徑小于500 nm的小油滴膠態(tài)分散體，平均粒徑是衡量乳液是否為納米乳液的關鍵指標，PDI表征分散體系中粒徑分布情況，PDI值越小，說明乳液體系中粒徑分布范圍越小，液滴分散性越好，體系越穩(wěn)定[14]。由圖1a(圖中不同小寫字母表示差異顯著，下同)可知，隨著SPI質(zhì)量分數(shù)從1%增加到2%，平均粒徑和PDI顯著下降(p<0.05)，粒徑分布圖從多峰變成單峰。這可能是因為1%的SPI不足以覆蓋油滴表面，未被乳化劑包被的油滴發(fā)生聚集產(chǎn)生大粒徑的液滴。隨著SPI質(zhì)量分數(shù)的增加實現(xiàn)了對油滴表面的更大覆蓋，從而防止聚集[15]，在SPI質(zhì)量分數(shù)為2%時平均粒徑最小。當SPI質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增加，納米乳液的平均粒徑增加，PDI值變化不顯著(p>0.05)，根據(jù)排斥絮凝理論，當SPI質(zhì)量分數(shù)過大時，連續(xù)相中未被吸附的蛋白分子因滲透聚集作用造成液滴絮凝，導致蛋白分子鏈隨絮凝乳滴排斥[16]。HEBISHY等[17]研究了乳清蛋白濃度對其穩(wěn)定的納米乳液粒徑的影響與本研究結(jié)果相似。

圖1 SPI質(zhì)量分數(shù)對魚油納米乳液平均粒徑、PDI、粒徑分布、ζ-電位和濁度的影響Fig.1 Effects of SPI concentrations on mean particle size and PDI, size distribution, ζ-potential and turbidity of fish oil nano-emulsions

水包油型乳狀液的穩(wěn)定性與ζ-電位絕對值有關，ζ-電位絕對值越大，乳液越趨于穩(wěn)定[18]。SPI和磷脂酰膽堿在pH值為7.0時表面均帶負電荷，因此乳液表面ζ-電位為負值。SPI質(zhì)量分數(shù)對魚油納米乳液ζ-電位影響不顯著(p>0.05)。乳液的濁度也可以表現(xiàn)乳液的穩(wěn)定性，隨著SPI質(zhì)量分數(shù)從1%增加到2%，濁度降低，有研究表明當油相體積分數(shù)固定，乳液粒徑是影響濁度的主要因素，二者呈正相關，乳滴平均粒徑越大，體系濁度越高，濁度與粒徑變化結(jié)果保持一致[19]。當SPI質(zhì)量分數(shù)超過2%，濁度隨SPI質(zhì)量分數(shù)的增加而增加，可能由油滴界面蛋白達到飽和，連續(xù)相中未被吸附蛋白含量增加所導致的。

根據(jù)SPI質(zhì)量分數(shù)對魚油納米乳液的平均粒徑、PDI、粒徑分布、ζ-電位和濁度的影響可以得出，構(gòu)建大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液最適SPI質(zhì)量分數(shù)為2%。

圖2 磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)對魚油納米乳液平均粒徑、PDI、粒徑分布、ζ-電位和濁度的影響Fig.2 Effects of phosphatidylcholine concentrations on mean particle size and PDI, size distributions, ζ-potential and turbidity of fish oil nano-emulsions

2.2 磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)

小分子表面活性劑和蛋白質(zhì)可以通過分子間相互作用在O/W界面共存，改變油滴表面吸附層的結(jié)構(gòu)和保護膜的厚度。表面活性劑的添加不僅可以降低界面張力，還可以防止聚結(jié)，從而提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定的O/W乳液的穩(wěn)定性[20]。由圖2a、2b可以看出，磷脂酰膽堿的加入顯著降低了大豆蛋白納米乳液的平均粒徑，粒徑分布的峰向粒徑小的方向移動，呈“高瘦”峰型，這是由于磷脂酰膽堿的親水基團——甘油磷酸酯基朝向水面排列，降低了油水界面的張力。繼續(xù)增加磷脂酰膽堿的含量，納米乳液平均粒徑、PDI值增加，粒徑分布圖呈“雙峰”峰型，說明磷脂酰膽堿加入過量，形成部分小粒徑納米乳滴，不利于乳液的穩(wěn)定。濁度結(jié)果與粒徑結(jié)果一致。隨著磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)的增加，納米乳液ζ-電位絕對值逐漸增加，部分研究指出這可能是由于磷脂酰膽堿與蛋白的交互作用改變了蛋白表面的電荷分布。GARCAMORENO等[21]報道了酪蛋白酸鈉-大豆磷脂復合物的形成產(chǎn)生有利的界面層結(jié)構(gòu)，從而改善了乳液的物理穩(wěn)定性。然而，當?shù)鞍踪|(zhì)穩(wěn)定的乳液中存在高濃度的表面活性劑時，表面活性劑分子憑借其較強乳化能力在油滴表面迅速展開，并部分滲入蛋白質(zhì)網(wǎng)絡，通過在O/W界面處的競爭性吸附逐漸取代蛋白質(zhì)，從而導致蛋白質(zhì)組成的乳化層瓦解，乳液穩(wěn)定性降低[20，22]。綜上，構(gòu)建大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液所需最適磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)為0.2%。

2.3 魚油質(zhì)量分數(shù)

魚油質(zhì)量分數(shù)對大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液平均粒徑和粒徑分布的影響如圖3a、3b所示。當魚油質(zhì)量分數(shù)從1%增加到1.5%時，納米乳液的平均粒徑、PDI值減小。然而，將魚油質(zhì)量分數(shù)從1.5%增加到3%導致平均粒徑和PDI值的顯著增加(p<0.05)，粒徑分布范圍增大。納米乳液粒徑的減小可歸因于未吸附的蛋白質(zhì)含量降低，隨后魚油質(zhì)量分數(shù)增加，導致液滴聚集減少。由于在魚油濃度增加時可用于覆蓋油滴的蛋白質(zhì)分子量不足，導致納米乳液的粒徑可能增加，魚油粘附在乳液液滴表面，導致液滴黏連，增強了液滴聚集。由圖3c可知ζ-電位隨魚油質(zhì)量分數(shù)的增加變化不顯著，無統(tǒng)計學意義，這一結(jié)果與MA等[23]的研究相似，認為姜黃素納米乳液的ζ-電位與油相濃度沒有很好的相關性。納米乳液的濁度隨魚油質(zhì)量分數(shù)增加顯著增加(p<0.05)。在確保納米乳液穩(wěn)定性的條件下，選擇魚油質(zhì)量分數(shù)為1.5%。

圖3 魚油質(zhì)量分數(shù)對魚油納米乳液平均粒徑、PDI、粒徑分布、ζ-電位和濁度的影響Fig.3 Effects of fish oil concentrations on mean particle size and PDI, size distribution, ζ-potential and turbidity of fish oil nano-emulsions

2.4 均質(zhì)壓力

圖4a、4b顯示了均質(zhì)壓力對納米乳液粒徑的影響。將壓力從0 MPa增加到100 MPa，乳液平均粒徑顯著降低(p<0.05)。在未高壓均質(zhì)的條件下，乳液的平均粒徑大于1 000 nm，未能形成納米乳液。在60～140 MPa的壓力下，乳液平均粒徑小于500 nm。因此，經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后，大豆蛋白-磷脂酰膽堿復合乳化劑可用于制備納米乳液。納米乳液的粒徑隨著壓力從60 MPa增加到100 MPa而下降。泰勒公式可以解釋粒徑隨著均質(zhì)壓力增加而減小的情況，該公式表明隨著與壓力相關的剪切速率的增加，粒度減小，壓力越高，剪切速率越大，這將最終導致粒度的減小[24]。隨著壓力進一步增加至140 MPa，納米乳液的平均粒徑變化不顯著，但是通過粒徑分布(圖4b)可以看到在大于1 000 nm處有粒徑新峰出現(xiàn)，可能是因為均質(zhì)壓力過大導致蛋白變性，乳液不穩(wěn)定發(fā)生聚集，這一結(jié)果與FERNANDEZ-AVILA等[25]研究的均質(zhì)壓力對大豆分離蛋白穩(wěn)定乳液粒徑的影響類似。ζ-電位絕對值變化不顯著，濁度隨均質(zhì)壓力的增加先顯著降低后變化不顯著，與粒徑結(jié)果一致。綜上，為減少生產(chǎn)消耗并保證納米乳液質(zhì)量，選擇100 MPa作為制備大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液的均質(zhì)壓力。

圖4 均質(zhì)壓力對魚油納米乳液平均粒徑、PDI、粒徑分布、ζ-電位和濁度的影響Fig.4 Effects of homogenizing pressures on mean particle size and PDI, size distribution, ζ-potential and turbidity of fish oil nano-emulsions

基于上述單因素試驗的結(jié)果，確定了制備大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液的最優(yōu)參數(shù)：大豆SPI質(zhì)量分數(shù)2%，磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)0.2%，魚油質(zhì)量分數(shù)1.5%，均質(zhì)壓力100 MPa，在此條件下制備的納米乳液的平均粒徑為(245±3.1)nm，PDI為0.226±0.019，ζ-電位為(-30.2±0.6)mV，濁度為(2 413±34.7)cm-1，接下來對其進行微觀觀測和穩(wěn)定性研究。

2.5 魚油納米乳液的微觀觀測

圖5 魚油納米乳液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.5 Microstructures of fish oil nano-emulsions

超高分辨顯微鏡用于觀測大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液的乳滴分布及微觀結(jié)構(gòu)情況。由圖5可清晰看到，油滴呈球型均勻分散在連續(xù)相中，大豆蛋白沿著油滴周圍的油-水界面排列形成薄膜，雖然有的只能看到綠色的油滴可能是因為蛋白形成的界面膜太薄，蛋白信號弱被油滴信號掩蓋了。

2.6 魚油納米乳液的穩(wěn)定性

大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液在生產(chǎn)應用過程中難免會受外界環(huán)境的影響，因此研究了儲存溫度、pH值、鹽離子濃度對大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液穩(wěn)定性的影響。

2.6.1儲存溫度

吐溫魚油納米乳液在25℃及以上溫度儲存20 d后乳液平均粒徑顯著增加(p<0.05)，這種效應可歸因于在油-水界面處單層吐溫20的親水基團聚氧乙烯的熱脫水，膠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變形聚集[26]。最佳條件制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液只有在50℃，超過20 d后才顯示出不穩(wěn)定的跡象。對于所有其他儲存條件下的樣品和初始樣品(0 d)對照30 d內(nèi)平均粒徑(圖6)均未觀察到顯著差異(p>0.05)；ζ-電位與初始樣品無差異(p>0.05，圖未給出)，說明納米乳液的穩(wěn)定性較好。納米乳液不穩(wěn)定的主要原因是奧氏熟化，由于分散相在連續(xù)相中的溶解，小液滴逐漸消融，大液滴逐漸增大，乳液體系向著自由能降低的方向演變[27]。奧氏熟化速率可以通過使用液滴半徑的立方與時間的線性回歸來計算，其中當R2大于0.8時，表明奧氏熟化導致了納米乳液不穩(wěn)定[28]。儲存在50℃的魚油納米乳液的R2為0.94，因此可認為是奧氏熟化導致的魚油納米乳液不穩(wěn)定。其他導致平均液滴尺寸增大的原因可能是絮凝和聚結(jié)[29]。

圖6 儲存溫度對魚油納米乳液平均粒徑的影響Fig.6 Mean particle size of fish oil nano-emulsion under different storage temperature conditions

2.6.2鹽離子濃度

鹽是常見的食品添加劑，也存在于人體胃腸道中，可能會影響產(chǎn)品中或攝入后膠態(tài)遞送系統(tǒng)的功能性。鑒于此，本研究以吐溫為參照，考察了Na+濃度(0.1～0.5 mol/L NaCl)和Ca2+離子濃度(0.01～0.05 mol/L CaCl2)對魚油納米乳液穩(wěn)定性的影響。Na+、Ca2+的加入不會引起吐溫穩(wěn)定的魚油納米乳液平均粒徑的顯著變化，但ζ-電位的絕對值逐漸降低(圖7b)。Na+濃度對大豆蛋白-磷脂酰膽堿穩(wěn)定的魚油納米乳液平均粒徑和ζ-電位影響不大(圖7)，可能是由于大豆蛋白與磷脂酰膽堿的復合在液滴表面產(chǎn)生更大的電荷密度，被靜電吸引吸附到蛋白質(zhì)分子上的Na+會顯著增加吸附在油滴表面上的蛋白質(zhì)分子的數(shù)量[30]。這可以認為在納米乳液中的液滴之間產(chǎn)生大量的靜電排斥力以避免Na+的電荷中和作用[31]。

隨著Ca2+的加入，大豆蛋白-磷脂酰膽堿穩(wěn)定的魚油納米乳液平均粒徑增大(圖8a)，尤其是當濃度達到0.03 mol/L，粒徑急劇增加，ζ-電位絕對值減小(圖8b)。這可能是由于靜電斥力是維持大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液的主要作用力，在相對較低的鹽濃度下，靜電斥力仍然足夠強，以克服弱范德華力和疏水吸引力，但是在臨界鹽濃度以上時，其不足夠強以致吸引力占優(yōu)勢，導致液滴聚集[32]。

Ca2+對魚油納米乳液ζ-電位的影響大于Na+，在Ca2+作用下，納米乳液ζ-電位變化絕對值為16.9 mV，Na+作用下，納米乳液的ζ-電位變化絕對值為4.1 mV。這是因為多化合價的離子(Ca2+、Fe2+、Fe3+)比單化合價離子(Na+、Cl-、K+)產(chǎn)生的靜電屏蔽更強，在低濃度時可屏蔽的電荷數(shù)比單化合價離子多[12]。李冉等[33]也發(fā)現(xiàn)乳液對Na+的承受濃度要遠高于Ca2+的濃度，二價陽離子對乳液穩(wěn)定性的影響要顯著高于一價陽離子。因此，大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液可以抵抗一定濃度的Na+強度的影響而穩(wěn)定存在，Ca2+濃度變化對納米乳液穩(wěn)定性的影響較大。

圖7 Na+濃度對魚油納米乳液平均粒徑和ζ-電位的影響Fig.7 Effect of Na+ concentration on mean particle size and ζ-potential of fish oil nano-emulsion

圖8 Ca2+濃度對魚油納米乳液平均粒徑和ζ-電位的影響Fig.8 Effect of Ca2+ concentration on mean particle size and ζ-potential of fish oil nano-emulsion

2.6.3pH值

pH值會影響大豆蛋白的電離程度和乳化性，從而影響納米乳液的穩(wěn)定性。由圖9可以看出，pH值對吐溫穩(wěn)定的魚油納米乳液的平均粒徑影響不大(圖9a)，但隨著pH值的降低ζ-電位的絕對值逐漸減小(圖9b)，這可能是由于在低pH值下脂肪酸以質(zhì)子化形式存在，液滴表面上的負電荷減少[34]。大豆蛋白-磷脂酰膽堿穩(wěn)定的魚油納米乳液平均粒徑在pH值3.0～6.0范圍內(nèi)均較大，pH值8.0～10.0與pH值7.0相比變化不顯著(圖9a，p>0.05)，說明大豆蛋白-磷脂酰膽堿穩(wěn)定的魚油納米乳液在酸性條件下不穩(wěn)定發(fā)生絮凝聚集并且在堿性條件下穩(wěn)定(沒有相分離或聚集)。大豆蛋白-磷脂酰膽堿穩(wěn)定的魚油納米乳液的ζ-電位隨著pH值的減小而增加，當pH值為3.0、4.0時，ζ-電位為正值(圖9b)。由此可知：液滴絮凝主要是由于pH值接近蛋白質(zhì)的等電點(4.6)，液滴之間的靜電排斥降低,這促進了大豆蛋白-大豆蛋白和大豆蛋白-磷脂酰膽堿相互作用引起的顆粒聚集。雖然磷脂酰膽堿的乳化性受pH值影響小，但其含量少不能抵制乳液在等電點附近的聚集。

圖9 pH值對魚油納米乳液平均粒徑和ζ-電位的影響Fig.9 Effect of pH value on mean particle size and ζ-potential of fish oil nano-emulsion

3 結(jié)束語

以大豆蛋白-磷脂酰膽堿作為復合乳化劑，運用高壓均質(zhì)制備魚油納米乳液最佳制備工藝參數(shù)為：大豆SPI質(zhì)量分數(shù)為2%，磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)為0.2%，魚油質(zhì)量分數(shù)為1.5%，均質(zhì)壓力為100 MPa，得到魚油納米乳液平均粒徑為(245±3.1)nm，PDI為0.226±0.019，ζ-電位為(-30.2±0.6)mV，濁度為(2 413±34.7)cm-1。超高分辨顯微鏡結(jié)果表明，魚油能夠被大豆蛋白-磷脂酰膽堿包埋且均勻分布在乳液體系中；通過穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)：大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液分別在4℃和25℃儲存30 d均穩(wěn)定，比吐溫20魚油納米乳液儲存穩(wěn)定性好；對一定濃度的Na+有較好的抗性，Ca2+濃度變化對納米乳液穩(wěn)定性的影響較大；堿性條件穩(wěn)定，為魚油在食品行業(yè)的應用提供了理論依據(jù)。