CaCl2對(duì)纖維核誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白聚合能力的影響

徐紅華 謝明明 丁 瑞 馬金玉 高子雯 關(guān) 琛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

乳清濃縮蛋白(WPC)在特殊條件下可以自組裝形成纖維狀聚合物[1-3]。由于乳蛋白納米纖維具有特殊的功能性質(zhì)(如凝膠性[4]、增稠特性[5]、穩(wěn)定的乳化性[6-7]與泡沫穩(wěn)定性[8])，近年來在食品行業(yè)中應(yīng)用廣泛。這種纖維狀聚合物的形成過程可分為滯后期、生長期和穩(wěn)定期[9]。纖維形成機(jī)理主要為二次成核理論，即初級(jí)成核與二次成核。初級(jí)成核是在滯后期蛋白質(zhì)單體發(fā)生聚合形成穩(wěn)定的均相核結(jié)構(gòu)，均相核具有在纖維形成過程中最高的自由能；二次成核是指單體在均相核的表面有序排列，從而形成成熟纖維的過程[10-14]。研究發(fā)現(xiàn)在乳清分離蛋白形成纖維過程中加入二次核(成熟纖維)，滯后期時(shí)間縮短，加速纖維的形成[15]，均相核誘導(dǎo)蛋白形成纖維的研究報(bào)道較少。Ca2+會(huì)影響蛋白質(zhì)纖維自發(fā)形成的聚合結(jié)構(gòu)，LOVEDAY等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白在形成纖維過程中添加一定的CaCl2，會(huì)促進(jìn)纖維的形成，縮短滯后時(shí)間，但纖維的形態(tài)發(fā)生了變化，由長、細(xì)、半柔性變?yōu)槎绦?、彎曲。但是，目前的研究主要集中在CaCl2對(duì)WPC自發(fā)形成纖維的影響方面，鮮有核誘導(dǎo)方面的報(bào)道。本文通過比較添加CaCl2與未添加CaCl2對(duì)WPC自發(fā)形成的纖維以及均相核/二次核誘導(dǎo)WPC在聚合過程中硬度、黏度以及聚合率的差異，探討CaCl2對(duì)核誘導(dǎo)WPC聚合能力的影響，以期為改善乳清濃縮蛋白的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1主要材料

乳清濃縮蛋白WPC-80，美國HILMAR公司；CaCl2，純度99.99%，阿拉丁公司；硫黃素 T，Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2主要儀器

CP153型電子精密天平，奧豪斯儀器有限公司；DELTA320型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；3-18K型離心機(jī)，Sigma公司；KDN-102C型半自動(dòng)定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；HHW型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)流變儀，英國馬爾文公司；TA-XT2 PLUS型物性測定儀，英國STABLE MICRO SYSTEM公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡，日本日立公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品的制備

乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維加鈣(WPC自發(fā)+鈣)：參照LOVEDAY等[18]的方法略有改動(dòng)，將5.00 g WPC溶于去離子水中，用6 mol/L HCl調(diào)pH值為2.0，定容至100 mL。19 000g、4℃下離心20 min，取中層清液，利用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，用pH值2.0的去離子水(6 mol/L HCl調(diào)去離子水至pH值2.0)稀釋至3.0%。添加0.75 mol/L的CaCl2溶液，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%，CaCl2終濃度為50 mmol/L。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維(WPC自發(fā))：上述3.0%蛋白溶液，添加與CaCl2相同體積的pH值2.0去離子水，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

均相核誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維加鈣(均相核誘導(dǎo)WPC+鈣)：3.0%的WPC，90℃下加熱2 h形成均相核[19-20]。均相核與3.0% WPC溶液以質(zhì)量比1∶3混勻，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%(pH值2.0)。添加0.75mol/L的CaCl2溶液，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%，CaCl2終濃度為50 mmol/L。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

均相核誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維(均相核誘導(dǎo)WPC)：3.0%的均相核WPC混合液，添加與CaCl2相同體積的pH值2.0去離子水，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

二次核誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維加鈣(二次核誘導(dǎo)WPC+鈣)：3.0%的WPC，90℃下加熱10 h形成成熟纖維即二次核。二次核與3.0% WPC溶液以質(zhì)量比1∶3混勻，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%(pH值2.0)。添加0.75 mol/L的CaCl2溶液，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%，CaCl2終濃度為50 mmol/L。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

二次核誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維(二次核誘導(dǎo)WPC)：3.0%的二次核WPC混合液，添加與CaCl2相同體積的pH值2.0去離子水，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

1.2.2質(zhì)構(gòu)特性

將pH值2.0的3.0% WPC、均相核、二次核與11.0% pH值2.0的WPC溶液以體積比1∶1混勻，使其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.0%?；旌先芤杭尤?.75 mol/L CaCl2，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.53%，CaCl2終濃度為50 mmol/L，于燒杯中90℃水浴加熱5 h。對(duì)照樣為蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.0%的混合液，加入與CaCl2相同體積的pH值2.0去離子水,蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.53%。放置4℃冰箱12 h，次日取出恢復(fù)至室溫(20℃)。采用質(zhì)構(gòu)剖面分析方法(Texture profile analyse, TPA)測定樣品的硬度、膠粘性指數(shù)、彈性指數(shù)以及咀嚼性指數(shù)，參數(shù)設(shè)定為：測試前速度1 mm/s，測試速度1.7 mm/s，測試后速度2 mm/s，下壓距離10 mm，引發(fā)力5 N，探頭型號(hào)A-BE-D35[21]。

加鈣樣品較對(duì)照樣硬度增加量為

N=NCa-N0

(1)

式中N——硬度增加量，g

NCa——加鈣樣品硬度，g

N0——對(duì)照樣硬度，g

加鈣樣品較對(duì)照樣膠粘性指數(shù)增加量為

A=ACa-A0

(2)

式中A——膠粘性指數(shù)增加量

ACa——加鈣樣品膠粘性指數(shù)

A0——對(duì)照樣膠粘性指數(shù)

1.2.3表觀黏度

1.2.1節(jié)中的樣品于90℃水浴加熱0、1、2、3、4、5、7、10 h，使用旋轉(zhuǎn)流變儀測定樣品的黏度。選擇直徑60 mm的平行板，板間距150 nm，剪切速率變化范圍為0.01～100 s-1，用一次性膠頭滴管吸取2 mL溶液，使樣品均勻分布于底部平板上[22],在剪切速率為10 s-1時(shí)取值。

加鈣樣品較對(duì)照樣黏度的增加量為

B=BCa-B0

(3)

式中B——加熱10 h的黏度增加量，Pa·s

BCa——加鈣樣品在加熱10 h的黏度，Pa·s

B0——對(duì)照樣在加熱10 h的黏度，Pa·s

1.2.4蛋白聚合率

1.2.1節(jié)中的樣品于90℃水浴加熱0、2、5 h，取20 mL樣液于50 mL離心管中，15 000g、4℃離心30 min，取上層清液，利用凱氏定氮法測定蛋白含量，計(jì)算公式為

C=1-Ct/CWPC0h

(4)

式中C——蛋白聚合率

CWPC0h——WPC自發(fā)加熱0 h的蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

Ct——樣品加熱t(yī)時(shí)的蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

1.2.5Th T熒光分析

1.2.1節(jié)中的樣品于90℃水浴加熱，每隔1 h取樣(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)。用含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0)配制800 mg/L的甲硫磺素T(Th T)的溶液。用水系0.22 μm濾膜過濾，濾液即為Th T儲(chǔ)備液。放置于棕色瓶中并于4℃冰箱避光保存。測定時(shí)將Th T儲(chǔ)備液用含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0)稀釋50倍，得到Th T工作液；取800 μL樣品加入10 mL的Th T工作液中，旋渦震蕩1 min后，于熒光分光光度計(jì)下比色。設(shè)定參數(shù)為：激發(fā)波長460 nm，發(fā)射波長490 nm，狹縫寬度5 nm和10 nm，測定不同加熱時(shí)間下樣品的熒光強(qiáng)度[23]。

1.2.6透射電鏡

1.2.1節(jié)中的樣品于90℃下加熱5 h，在4℃冰箱中保存12 h，取出后放至室溫。用超純水將樣品稀釋至1 mg/mL，取稀釋液滴于透射電鏡專用銅網(wǎng)上吸附20 min，用濾紙吸除多余液體，在室溫下干燥10 min，在80 kV電壓下觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)[24]。

1.2.7數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 10進(jìn)行制圖和IBM SPSS Statistics v 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析，檢驗(yàn)差異顯著性(P<0.05)。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠質(zhì)構(gòu)特性

結(jié)果如表1所示，未加鈣樣品其硬度與膠粘性均為核誘導(dǎo)WPC高于其自發(fā)聚合，并且二次核誘導(dǎo)略高于均相核誘導(dǎo)。CaCl2的加入可以明顯改善WPC樣品的凝膠質(zhì)構(gòu)，但核誘導(dǎo)的提高幅度更大，從CaCl2添加前后WPC凝膠硬度的提升差值可以看出(圖1)，核誘導(dǎo)WPC分別是其自發(fā)聚合的1.661倍(均相核誘導(dǎo))和1.821倍(二次核誘導(dǎo))；膠粘性提升量分別是其自發(fā)聚合的2.544倍(均相核誘導(dǎo))和2.129倍(二次核誘導(dǎo))。上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，相對(duì)WPC自發(fā)聚合，CaCl2的加入對(duì)核誘導(dǎo)WPC聚合的影響更大。

表1 凝膠質(zhì)構(gòu)特性Tab.1 Textural properties of different samples

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 表觀黏度

纖維形成過程中Ca2+的影響也存在很大差異，Ca2+在自發(fā)與核誘導(dǎo)2種不同形成方式中的作用也有很大不同。在形成過程中，黏度均呈上升趨勢。核誘導(dǎo)WPC形成的纖維聚合物其黏度高于WPC自發(fā)聚合，同時(shí)，添加CaCl2的樣品其黏度較對(duì)應(yīng)的未添加CaCl2樣品均有升高，在前2 h的滯后期差異不大，隨著熱聚合的持續(xù)，Ca2+的影響程度增大(圖2a)；在形成方式中，Ca2+在自發(fā)與核誘導(dǎo)中的作用有很大不同，添加CaCl2后對(duì)核誘導(dǎo)聚合的改善幅度更大，均相核誘導(dǎo)WPC與二次核誘導(dǎo)WPC其黏度增加量分別是WPC自發(fā)黏度增加量的2.261與2.479倍(圖2b)。

圖1 WPC自發(fā)、均相核誘導(dǎo)WPC、二次核誘導(dǎo)WPC添加CaCl2后纖維凝膠硬度與膠粘性的變化Fig.1 Changes of hardness and gumminess by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

圖2 WPC自發(fā)、均相核誘導(dǎo)WPC、二次核誘導(dǎo)WPC添加CaCl2后形成纖維的黏度變化Fig.2 Changes of viscosity by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

表明CaCl2的加入對(duì)核誘導(dǎo)WPC熱聚合的提高幅度更大。

2.3 蛋白聚合率

通過聚合率可從側(cè)面研究蛋白質(zhì)的聚合能力。由圖3可知，隨著加熱時(shí)間延長，不同樣品的聚合率均有上升，這表明延長熱處理時(shí)間會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)之間聚合形成大分子聚合物。且核誘導(dǎo)WPC形成的蛋白聚合率高于WPC自發(fā)聚合。樣品添加CaCl2后其聚合率明顯提高，但是，在纖維形成的不同時(shí)期Ca2+的影響程度不同，未經(jīng)過熱處理(0 h)Ca2+的混入就可以提高聚合程度；隨著熱處理的進(jìn)行，在纖維形成滯后期(2 h)Ca2+的混入可以較大幅度提高其聚合程度；生長期(5 h)Ca2+的影響程度降低，聚合率差值減小。

圖3 WPC自發(fā)、均相核誘導(dǎo)WPC、二次核誘導(dǎo)WPC添加CaCl2后形成的纖維在熱處理過程中聚合率的變化Fig.3 Changes of polymerization by adding CaCl2to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

2.4 透射電鏡

通過透射電鏡觀察添加CaCl2對(duì)纖維微觀形態(tài)的影響。CaCl2的加入明顯改變纖維的形態(tài)，由細(xì)長半柔性的纖維(圖4a、4b、4c)變?yōu)槎绦澢鷪F(tuán)簇聚集狀(圖4d、4e、4f)，表明添加50 mmol/L CaCl2對(duì)WPC的聚合有促進(jìn)作用。核誘導(dǎo)形成的纖維數(shù)量較WPC自發(fā)形成的纖維多。對(duì)于自發(fā)與核誘導(dǎo)兩種纖維形成方式，加鈣WPC自發(fā)是獨(dú)立的纖維團(tuán)簇聚集體而核誘導(dǎo)則是纖維團(tuán)簇聚集體之間相連，CaCl2對(duì)核誘導(dǎo)形成的纖維聚合影響更大。

圖4 WPC自發(fā)、均相核、二次核誘導(dǎo)WPC添加CaCl2后加熱5 h形成的纖維透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron micrographs of different samples heated for 5 h at 90℃ and pH value of 2.0

2.5 Th T熒光分析

Th T是一種熒光染料，可以與纖維的β-折疊結(jié)合，間接反映纖維的產(chǎn)量[8]。均相核與二次核誘導(dǎo)WPC形成的纖維其熒光強(qiáng)度較WPC自發(fā)聚合高(圖5)，表明核誘導(dǎo)較WPC自發(fā)形成纖維數(shù)量多?；烊隒a2+后在纖維形成的不同時(shí)期存在不同程度的影響。在滯后期(0～2 h)添加CaCl2的WPC自發(fā)與均相核誘導(dǎo)較對(duì)照樣熒光強(qiáng)度高，表明CaCl2在其滯后期促進(jìn)纖維的形成，但在生長期與穩(wěn)定期熒光強(qiáng)度較對(duì)照樣低。二次核誘導(dǎo)WPC在加熱0～1 h，添加CaCl2的樣品與對(duì)照樣其熒光強(qiáng)度相近，從2 h開始，添加CaCl2的二次核誘導(dǎo)WPC其熒光強(qiáng)度較對(duì)照樣低。由此可推測，CaCl2并沒有影響纖維核結(jié)構(gòu)的形成，但會(huì)促進(jìn)隨后的聚合。纖維聚合在一起，Th T無法充分地與聚合纖維結(jié)合[25]，從而影響了熒光強(qiáng)度的結(jié)果。

圖5 WPC自發(fā)、均相核誘導(dǎo)WPC、二次核誘導(dǎo)WPC添加CaCl2后熱處理過程中Th T熒光強(qiáng)度的變化Fig.5 Changes of Th T fluorescence intensity by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

3 結(jié)論

(1)CaCl2會(huì)提高纖維體系的黏度、硬度與聚合率，并且CaCl2對(duì)核誘導(dǎo)形成的纖維影響更大。

(2)CaCl2的加入對(duì)纖維的形態(tài)有影響，使纖維由細(xì)長直鏈變?yōu)閺澢奂臓顟B(tài)，促進(jìn)纖維之間的聚合，并且對(duì)核誘導(dǎo)的纖維影響更大。

(3)在加熱初期，添加CaCl2對(duì)WPC自發(fā)與均相核誘導(dǎo)WPC形成纖維有促進(jìn)作用。在加熱后期，加鈣樣品的熒光強(qiáng)度較未加鈣樣品低。